למעלה
קביעת הרכבי לפידים בזקיקים משלבי התפתחות ואיכות שונים בשחלות בקר
דו"ח לתכנית מס' 05- 354-0158
מוגש ע"י ד"ר עוזי מועלם, המכון לחקר בע"ח, מרכז וולקני ופרופ' עמי אריאלי, הפקולטה לחקלאות, רחובות.
תקציר
מחקרים שונים מצאו כי הזנה בשומן אצל פרות חלב גורמת לשינויים רבים בדינמיקה של התפתחות הזקיקים בשחלה ואולם המנגנון אינו ברור דיו. עבודת מחקר זו עוסקת בהרחבת המידע העוסק בתפקידם של הליפידים בפעילות השחלתית ובעיקר בניסיון להבנת המנגנון הקשור בחומצות השומן והכולסטרול. במסגרת זו נעשה ניסוי ראשון ובו נאספו שחלות מבית המטבחיים, והזקיקים הופרדו מן השחלות לפי גודלם. חיוניותם של הזקיקים נקבעה לפי צלילות הנוזל הפוליקולרי ונוכחות כלי דם. הנוזל הפוליקולרי נשאב מן הזקיקים ונקבע בו תכולת FA כולסטרול, וריכוז הליפופרוטאינים לפי המקטעים השונים. כפי שדווח בשנה קודמת ריכוז חומצות השומן החופשיות בנוזל הפוליקולרי יורד בכ- 40% בזקיקים שקוטרם מעל 4 מ"מ לעומת זקיקים קטנים יותר. לעומת זאת ריכוז הכולסטרול הולך ועולה ככל שהזקיק גדל כאשר יש עלייה משמעותית בריכוז הכולסטרול בזקיקים שקוטרם מעל 4 מ"מ לעומת אלה שקוטרם מ- 4 מ"מ ומטה. כמו כן נמצא כי שיעור ה- HDL בזקיקים הוא הגבוה ביותר מבין שאר מרכיבי מקטעי הליפרוטאינים. ריכוז ה- LDL ו- – VLDL בנוזל הזקיקי של הזקיקים האנטרלים הקטנים היה נמוך מן הזקיקים האנטרלים הגדולים. לעומת זאת בזקיקים האנטרליים הקטנים ריכוז ה- HDL היה גבוה יותר מאלה של הזקיקים האנטרליים הגדולים. בשנה הנוכחית התמקד המחקר בביטוי הגנים לליפופרוטאינים בשלבים שונים של התפתחות הזקיק. נבחנה התבטאות הגנים לארבעה רצפטורים: LDLr ו- VLDLr שהינם רצפטורים אנדוציטוטיים ושני רצפטורים סלקטיביים: SRB1 – LPR8. נמצאו בהתבטאות הגנים הסלקטיביים בשלבי ההתפתחות השונים של הזקיק כאשר ככל שהזקיק בשלב התפתחות גבוה יותר, הביטוי לשל הגנים לרצפטורים הסלקטיביים גדול יותר. לעומת זאת התבטאות הגנים לרצפטורים הציטוטיים היה גדול יותר בזקיקים בשלבי התפתחות מוקדמים וקטן ככל שהזקיק גדל. הבדל זה מעיד כי מנגנון החדרת כולסטרול לתאים מבוקר באופן שונה ככל שהזקיק מתפתח וכי תהליך רגולציה זה מאפשר כניסה גדולה יותר של כולסטרול עם התפתחות הזקיק. שנת המחקר השלישית בהבנת המנגנון הקשור בחומצות שומן וכולסטרול בזקיקים בעלי איכות שונה שנשאבו מפרות in vivo.
רקע
טכניקת ההגנה על שומן שפותחה לפני כשני עשורים, אפשרה את הגדלת שיעורי השומן במנות בקר לחלב. במקביל נבחנה השפעת הגדלת השומן במנות בקר לחלב על מערכת הרבייה. בניסויים רבים נבחנה השפעת תוספת שומן מוגן במנת פרות לחלב בראשית התחלובה על צמצום המאזן האנרגטי והשפעתו השלילית על מערכת הרבייה. בסדרה של ניסויים שערכנו בארץ נמצא כי תוספת השומן המוגן שניתנה במנה הגבירה את ייצור החלב והשומן, אבל לא תרמה לשיפור משמעותי במאזן האנרגטי, ובמקרים מסוימים אף הובילה להגברת פירוק הרקמות גופניות. למרות זאת נמצא שיפור בשיעורי ההתעברות עם ההזנה בשומן וכן צמצום מובהק בימי ריק. ממצא זה הוביל למחקרים נוספים שבהם ניסו לקבוע מנגנון ישיר שבו השומן משפיע על מערכת הרבייה.
עבודות נוספות בחנו את השפעת תוספת שומן במנה על הדינמיקה של התפתחות זקיקים בשחלות בקר. בעבודה שלLucy et al. (1991) נמצא כי אצל פרות שהוזנו בשומן מוגן מיד לאחר ההמלטה מספר הזקיקים הבינוניים (6-9 מ"מ) היה גדול יותר ואלו מספר הזקיקים הקטנים (3-5 מ"מ) היה קטן לעומת פרות הבקורת. כמו כן מספר הזקיקים הגדולים (15מ"מ< ) היה גדול יותר אצל הפרות שהוזנו בשומן לעומת פרות הבקורת. בניסוי נוסף שלLucy et al. (1993) נמצאה השפעה חיובית להזנה בשומן על גודל הזקיקים הדומיננטיים, בעיקר של אילו מן הגל השני. השפעות אילו נמצאו ללא הבדלים במאזן האנרגיה וניתן לייחס אותם ישירות להזנה בשומן.
בעבודה שנעשתה על ידינו (Moallem et al., 1999), נשאב נוזל מזקיקים פרהאובולטוריים in vivo. בעבודה זו נמצא כי נפח הנוזל הפוליקולרי מזקיקים של פרות שהוזנו בשומן היה גדול בכ- 50% מזקיקים של פרות ביקורת, 3.14 לעומת 2.07 מ"ל בהתאמה. ממצאים נוספים מעבודה זו מעידים כי ככל הנראה להזנה בשומן יש השפעה מעכבת על התפתחות גלים פוליקולריים חדשים במהלך המחזור המיני, כלומר קיימת תדירות שחלוף נמוכה יותר של גלים פוליקולריים ולכן הזקיק הדומיננטי המתפתח גדול יותר. ממצאים אלה מחזקים את ההשערה כי השפעות השומן הנן ישירות על מערכת הרבייה ולאו דווקא באמצעות שיפור במשק האנרגיה של הפרה.
מחקרים נוספים בחנו את השפעות ההזנה בשומן על הפרשת הורמונים סטרואידים מן השחלה. הנחת היסוד הייתה כי תוספת בהפרשת ההורמונים נובעת בין היתר מהגברת זמינות הכולסטרול בשחלה, והגברת זמינות הפרקורסור העיקרי לסטרואידים תגרום להפרשה גדולה יותר של הורמונים. בעבודות שנעשו בארץ (Sklan et al, 1991, Moallem et al, 1997) ואושרו בעבודות נוספות (Grummer et al., 1991; Beam et al., 1997), נמצא כי העלאת אחוז השומן במנה הגדילה את ריכוז הכולסטרול בפלסמה. תוספת זו בריכוזי הכולסטרול נבעה ככל הנראה מן התוספת בספיגת השומן מן המעי שנתקבלה עם הגברת זמינות השומן במנה.
בעבודה שלנו ((Sklan et al., 1991 נמצא שתוספת שומן מוגן במנה הגדילה את הפרשת הפרוגסטרון מן הגוף הצהוב במחזור שקדם להזרעה ראשונה אצל פרות שהוזנו בשומן לעומת פרות ביקורת.
בעבודה נוספת שלנו (Moallem et al., 1999), נמצא כי בנוזל פוליקולרי של זקיקים פרהאובולטוריים, ריכוז הפרוגסטרון היה גבוה יותר אצל פרות שהוזנו בשומן לעומת פרות ביקורת (55.4 לעומת 33.0 ng/ml בהתאמה). להפרשת הפרוגסטרון מן הגוף הצהוב יש כידוע תפקיד חיוני ומכריע בהכנת הרחם להשתרשות העובר, ובהמשך לתמיכה ותחזוקה של ההריון על ידי עידוד אספקת חומרי מזון לעובר. הגברת הפרשת הפרוגסטרון על ידי הגברת זמינות השומן, עשויה לצמצם את התמותה העוברית בראשית ההיריון ולהגדיל את שיעור ההריונות.
מעורבותם של חומצות שומן, ובמיוחד החומצות רב הבלתי רוויות בוויסות תהליכים ביוכימיים חשובים, נמצאו גם במערכת הרבייה. בעבודות שנעשו לאחרונה נמצאה השפעה לחומצות השומן הבלתי רוויות על הפרשת a2 PGF in vivo ו- in vitro (1998 Staples et al.,).
מספר עבודות ניסו לבחון את השינויים המתרחשים בהרכב הליפידים בפלסמה ובנוזל הפוליקולרי בהשפעת הזנה בשומן. Williams (1996) מצא כי הגדלת כמות השומן במנה הגדילה את אספקת הליפופרוטאינים לשחלה, ואלה ככל הנראה מהווים גורם חשוב בויסות הסטרואידוגנזה בשחלה. עבודה של Sharma et al. (1996) מראה כי תכולת הליפידים בנוזל הפוליקולרי משתנה במהלך התפתחות הזקיק. תכולת הליפידים עולה עם גדילת הזקיק עד הגיעו לשלב האנטרלי (Large Antral) ולאחר מכן תכולת הליפידים הולכת ויורדת. בעבודה זו נמצא כי תכולת הכולסטרול הולכת ועולה עם התפתחות הזקיק, ואילו תכולת חומצות השומן החופשיות הולכת ויורדת. בעבודה של Yao et al. (1980) שנעשתה בחזירים נמצא כי תכולת חומצות שומן חופשיות (FFA) בזקיקים קטנים (1-2 מ"מ) הייתה גבוהה יותר בכ- 56% לעומת תכולתם בזקיקים הגדולים (6-12 מ"מ). בעבודה זו של Yao et al. (1980) נמצאו הבדלים בהרכב הליפידים בזקיק עם הגדלת נפחו ושלבי התפתחותו מזקיק פרימורדיאלי עד לזקיק פרהאובולטורי. שינויים אילו נמצאו בהרכב חומצות השומן החופשיות וגם במקטעים של הפוספוליפידים בנוזל הפוליקולרי. בבחינת ההרכב היחסי של חומצות השומן החופשיות נמצאה נטייה לירידה בשיעור היחסי של הלינוליאית (18:2) עם גדילת הזקיק. עבודות נוספות מצאו כי השינויים העיקריים החלים בהרכב חומצות השומן הינם בריכוזם של החומצה האוליאית (18:1) הלינוליאית (18:2) והלינולינית (18:3). בעבודה של Homa et al. (1992) נמצא כי בזקיקים הגדולים יותר (7-13 מ"מ) ריכוזם של החומצה האוליאית והלינוליאית הנו נמוך יותר מרכוזם בזקיקים הקטנים יותר (1-3 מ"מ). בעבודה זו נמצאה קורלציה שלילית מובהקת בין גודל הזקיק לריכוז החומצה הלינוליאית, כלומר ככל שקוטרו של הזקיק היה גדול יותר ריכוז החומצה הלינוליאית בנוזל הפוליקולרי היה נמוך יותר.
בעבודה זו של Homa et al. (1992) נבחנה גם in vitro השפעת נוכחותן של חומצות שומן חופשיות בנוזל הפוליקולרי על GVBD (Geminal Vesicles Breakdown) של ביציות בקר. נמצא כי תוספת של חומצה לינוליאית in vitro עיכבה את ה- GVBD, שהינו תהליך חשוב בהתפתחות החלוקה המיוטית השנייה, וקיום ביוץ תקין. מתוצאות עבודות אילו ניתן לקבוע כי ככל הנראה לחומצות השומן הבלתי רוויות ובעיקר ללינולואית (18:2), יש תפקיד חשוב בהתפתחות הזקיק וכן במניעת הבגרה מוקדמת של הביצית הפוגעת בפוריות.
בעבודה שבצענו בארץ ((Moallem et al., 1999, נמצאו הבדלים בפלסמה בשיעור היחסי של החומצה האוליאית (18:1), הלינוליאית (18:2) והלינולינית (18:3) אצל פרות שהוזנו בשומן לעומת פרות הביקורת. בעבודה זו נשאב נוזל מזקיקים פרהאובולטוריים in vivoונקבע הרכב חומצות השומן במקטעי הליפידים השונים. בניתוח ההבדלים בהרכב היחסי של מקטעי הלפידים בין זקיקים פעילי אסטרדיול (E2-A) לעומת זקיקים שאינם פעילי אסטרדיול ( .(E2-Iהשיעור היחסי של החומצה האוליאית (18:1) והלינוליאית (18:2) במקטע ה- FFA היה קטן יותר בזקיקים פעילי אסטרדיול (E2-A) לעומת זקיקים שאינם פעילי אסטרדיול ( .(E2-Iנמצא גם כי ריכוז הפוספוליפידים בנוזל הזקיקים E2-A היה גבוה יותר לעומת זקיקים E2-I. כמו כן נמצאו הבדלים בריכוז היחסי של חומצות השומן במקטעי הפוספוליפידים של נוזל פוליקולרי מזקיקי E2-A לעומת E2-I. מתאם שלילי מובהק נמצא גם בין ריכוז האסטרדיול בזקיקים פרהאובולטוריים לבין השיעור היחסי של חומצה לינוליאית (18:2).
בעבודה נוספת שנעשתה בארץ שבחנה את ההבדלים בפרופיל ובריכוז חומצות השומן במקטע הפוספולידים של ביציות, תאי גרנולוזה ונוזל פוליקולרי בין חורף לקיץ. נמצא כי שיעור חומצות השומן הבלתי רוויות היה גבוה יותר בביציות, תאי גרנולוזה ונוזל פוליקולרי בחורף מאשר קיץ (Zeron et al., 2001).
חומרים ושיטות
נאספו שחלות בריאות מבית המטבחיים, נשטפו בסליין והובלו באמבט ב- 370. הזקיקים הופרדו מן השחלות לפי גודלם ונקבעו 4 גדלים 1) 4- 2 מ"מ. 2) 5-7 מ"מ 3) 8-10 מ"מ 4) 10 מ"מ <. חיוניותם של הזקיקים נקבעה לפי צלילות הנוזל הפוליקולרי, ונוכחות כלי דם.
הנוזל הפוליקולרי נשאב מן הזקיקים ונקבע בו תכולת FA בכרומטוגרפיה גזית וכולסטרול כמתואר ( (Moallem et al, 1999. ריכוז הליפופרוטאינים בנוזל הפוליקולרי והפלסמה נקבע ב- HPLC כמתוארKnobler, 1987) ).
RNA הופק באמצעות Tri-reagent.
על מנת ליצור גלאי (פרוב) אשר יזהה התבטאות הספציפית של הגנים המקדדים לקולטני הליפופרוטאינים, בוצעו השלבים הבאים:1) הופק RNA תאי טקה, גרנולוזה וגוף צהוב. 2) RNA זה הוכנס לPCR יחד עם תחלים ספציפיים לגן המקדד לקולטן הנבחן 3) ריאקצית RT–PCR מגבירה תוצר ספציפי (מקטע cDNA) שנשלח לקביעת רצף בסיסים. 4) קביעת רצף הנוקלאוטידים מאפשר את קביעת רצף חומצות האמינו וקביעת ההומולוגיה בין הגנים שנבחנו ובין הגנים בהמדווחים בבנק הגנים. 5) מקטעים שבודדו משמשים כגלאים להתבטאות הגן הנבחן בניסויים שהתבצעו לפי שיטות העומדות במעבדתנו (Argov, et al., 2003).
הנוזל הפוליקולארי הופרד על גבי קולונה (Gel filtration ) ובעזרתה נבדקו רמתם היחסיות של הליפופרוטאינים בדם. רמות ה- HDL , LDL ו- VLDL מבוטאות יחסית לרמות האלבומין בדם.
תוצאות ודיון
בעבודת מחקר זו זוהה לראשונה בשחלת יונק ובבקר מקטע – 8 LRPופורסם בבנק הגנים. כמו כן זוהו לראשונה בשחלות בקר מקטעים מן הגנים המקודדים ל- LDLr ו- VLDLr .
גרף מס' 1: רמות ביטוי של הגןSRB1 בזקיקים בשלבי התפתחות שונים.
ביטוי הגן ל- SRB1 שהינו רצפטור סלקטיבי מופיע בגרף מס' 1. מן הגרף נראה כי ישנה מגמת עלייה ברמות הביטוי של הגן המקודד ל- 1SRB ואולם ההבדלים בין שלבי ההתפתחות השונים לא נמצאו מובהקים.
גרף מס' 2: רמות הביטוי לגן LPR8 בזקיקים בשלבי התפתחות שונים.
רמות ביטוי הגן המקודד לרצפטור הסלקטיבי השני שנבחן – LRP8, בשלבי ההתפתחות השונים של הזקיקים מופיעים בגרף מס' 2. רמות הביטוי של גן זה הלכו ועלו עם גדילת הזקיק.
לעומת זאת, מגמה הפוכה נמצאה לגבי רמות הביטוי של הגנים הצטיטוטיים, LDLr ו- VLDLr כפעי שמופיעים בגרפים מס' 3 ו- 4. רמות הביטוי של הגנים של שני רצפטורים אלה הלכו וירדו עם גדילת הזקיק.
חשיבותם של רצפטורים אלה הינה גדולה מאוד, במיוחד כאשר הזקיק נמצא בשלבים מתקדמים של התפתחותו. רצפטורים אלה המסייעים לכניסת הליפופרוטאינים לתאים, מאפשרים למעשה כניסה של כולסטרול המהווה פרקורסור לסטרואידים המסונתזים בזקיקים, וכן ליפידים שחשובים לתהליכי הפקת אנרגיה ובניית ממברנות. עם צמיחת הזקיק יש עלייה בנוכחות הרצפטורים הסלקטיביים, ואלה מאפשרים קליטה של כולסטרול מן הליפופרוטאינים. לרצפטור SRB1יש יתרון על פני LRP8 בכל שהוא מסוגל לקלוט כולסטרול גם מה- LDL העשיר יותר מכולסטרול מאשר ה- HDL, בעוד ה- LRP8 מסוגל לקלוט כולסטרול רק מ- HDL. בשלבי ההתפתחות המתקדמים של הזקיק, הוא מסנתז כמויות גדולות של אסטרדיול וזה דורש מערכת יעילה של החדרת כולסטרול לתאים. נראה כי מערכת הקליטה הסלקטיבית הינה יעילה יותר אשר זו הציטוטית, ולכן עם צמיחת הזקיק עולה ביטוי הגנים לרצפטורים אלה.
גרף מס' 3: רמות הביטוי של הגן ל- LDLr בשלבי התפתחות שונים של הזקיקים.
גרף מס' 4: רמות הביטוי של הגן ל- VLDLr בשלבי התפתחות שונים של הזקיקים.
גרף מס' 5: ריכוזי מקטעי הליפופרוטיאינים השונים בשלבי התפתחות שונים של הזקיקים.
בחלק הראשון של עבודת המחקר נסדקו ריכוזי הכולסטרול בנוזל הפוליקולרי ונמצא כי יש עלייה מובהקת בריכוזי הכולסטרול עם התפתחות הזקיק. ריכוזי ה- LDL בנוזל הפוליקולרי כפי שנראה בגרף מס' 5 עולים עם העלייה בקוטר הזקיק. ידוע כי ריכוז הכולסטרול ב- LDL הינו הגבוה ביותר מבין הליפופרוטיאינים. ככל הנראה מסיבה זו יש העדפה לשימוש ב- LDL על מנת להגביר את אספקת הכולסטרול לזקיק המתפתח.
הרצפטורים הסלקטיביים נבדלים בכך ש- SRB1 מסוגל לקלוט כולסטרול רק מ- HDL ואילו ה- 8LRP מסוגל לקלוט גם מה- LDL העשיר בכולסטרול. העלייה ברמות ביטוי הגנים של 8LRP עם גדילת הזקיק מגבירה את קליטת הכולסטרול בזקיקים גדולים מ- LDL.
מסקנות חלק זה של עבודת המחקר מראות כי קיים מודל שונה של העברת כולסטרול לזקיק בשלבים שונים של התפתחותו. שינויים אלה נובעים ככל הנראה מן ההבדלים בדרישה לכולסטרול עם העלייה בנפח הזקיק, ושימוש במסלולים יעילים בהעברת הכולסטרול מן הפלסמה אל הזקיקים.
בחלק השלישי של העבודה יבדקו פרמטרים הקשורים לחומצות שומן וכולסטרול מזקיקים באיכות שונה שנשאבו מפרות in vivo.
רשימת ספרות
Beam S.W., Butler W.R. 1997. Energy balance and ovarian follicle development prior to the first ovulation postpartum in dairy cows receiving three levels of dietary fat. Biol. Reprod. 56: 133.
Grummer, R. R., and D. J. Carroll. 1991. Effects of dietary fat on metabolic disorders and reproductive performance of dairy cattle. J. Anim. Sci. 69:3838.
Homa, S. T., and C. A. Brown. 1992. Changes in linoleic acid during follicular development and inhibition of spontaneous breakdown of germinal vesicles in cumulus-free bovine oocytes. J. Reprod. Fertil. 94:153.
Lucy, M. C., C. R. Staples, F. M. Michel, and W. W. Thatcher. 1991. Effect of feeding calcium soaps to early poatpartum dairy cows on plasma prostaglandin F2, luteinizing hormone, and follicular growth. J. Dairy Sci. 74:483.
Lucy, M. C., R. L. De La Sota, C. R. Staples, and W. W. Thatcher. 1993. Ovarian follicular populations in lactating dairy cows treated with recombinant bovine somatotropin (sometribove) or saline and fed diets differing in fat content and energy. J. Dairy Sci. 76:1014.
Moallem U, Kaim M, Folman Y, Sklan D. 1997. Effect of calcium soaps of fatty acids and administration of somatotropin in early lactation on productive and reproductive performance of high producing dairy cows. J. Dairy Sci. 80: 2127.
Moallem U, Folman Y, Bor A, Arav A, Sklan D. Effect of calcium soaps of fatty acids and administration of somatotropin on milk production, preovulatory follicular development, and plasma and follicular fluid lipid composition in high yielding dairy cows. J. Dairy Sci. 1999; 82: 2358.
Sharma, R. K., R. Vats, and A. K. Sawhney. 1996. Changes in follicular lipids during growth in the goat ovary. Small Rumin. Res. 20:177.
Sklan, D., U. Moallem, and Y. Folman. 1991. Effects of feeding calcium soaps of fatty acids on production and reproduction responses in high production lactating cows. J. Dairy Sci. 74:510.
Staples, C. R., J. M. Bruke, and W. W. Thatcher. 1998. Influence of supplemental fats on reproductive tissues and performance of lactating cows. J. Dairy Sci. 81: 856.
Williams, G. L. 1996. Influence of dietary fat intake and metabolism on follicular growth in cattle. Reprod. Domes. Anim. 31:539.
Yao J.K., Ryan R.J., and Dyck, P.J. 1980. The porcine ovarian follicle. VI. Comparison of fatty acid composition of serum and follicular fluid at different development stages. Biol. Reprod. 22:141.
Zeron, Y., A. Ocheretny, O. Kedar, A. Borochov, D. Sklan, and A. Arav . 2001. Seasonal changes in bovine fertility: relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles. Reprod. 121:447.
