ציסטות שחלתיות בפרות חלב: קביעת פרופילים הורמונאליים ומטבוליים טרם הופעתם והצעות לטיפול

דוח מסכם לתוכנית מחקר 362-0261-10

רות בראב-טל, צבי רוט, משה קאים

תקציר

השראת ציסטות שחלתיות באמצעות מתן ACTH שימש כמודל לבחינת הפגיעה בציר האנדוקריני היפותלמוס-היפופיזה-שחלה בעקבות עקה מושרת. ACTH גרם להארכת מחזור הייחום ולהיווצרות מבנים דמויי ציסטות שחלתיות, המאופיינים ביכולת סטרואידוגנית ירודה ובירידה ברמת ביטוי ה- mRNA של חלבון ואנזימים המעורבים בסטרואידוגנזה.

במחקר הנוכחי, אפיינו שינויים המתחוללים בתהליכי הסטרואידוגנזה בזקיק הדומיננטי, במהלך היווצרות פתולוגיות שחלתיות. שינויים אלו יכולים להסביר, גם אם באופן חלקי, מהו המנגנון אשר גורם לכשל ביוצי ולהתפתחות זקיק מתמיד או ציסטות שחלתיות בפרות החלב, בתקופה שלאחר ההמלטה ותחת תנאי עקה.

מבוא

התפתחות ציסטה שחלתית בפרות החלב היא אחד הגורמים העיקריים לירידה בפוריות עדר החלב. קיימת שונות רבה בהיקף הפגיעה בין העדרים השונים (5.6-18.8%), זאת בשל הגורמים הרבים המובילים להתפתחות ציסטות. הנזק העיקרי מתבטא בדחיית מועד ההתעברות בכ- 22-64 ימים ומוערך ב- 137 US$לפרה ציסטית בתחלובה.

מטרות המחקר הנוכחי היו (1) לאפיין דינאמיקת ההתפתחות של ציסטות שחלתיות וזקיקים מתמידים בפרות חלב בתקופה שלאחר ההמלטה, בדגש על ראשית התהוותן, (2) לאפיין שינויים בפרופיל ההורמונאלי בדם ההיקפי ובנוזל הפוליקולרי בעת היווצרות ציסטה שחלתית וזקיק מתמיד ו- (3) לאפיין שינויים הנגרמים בזקיק הקדם ביוצי בעקובת כשל ביוצי הנגרם מתנאי עקה, בכלל זה שינויים בסטרואידוגנזה ובביטוי גנים המעורבים בסטרואידוגנזה בזקיק.

המחקר כלל שני ניסויים מרכזיים :

ניסוי 1 (שנה א): מעקב אחר דינאמיקת התפתחות ציסטות שחלתיות וזקיקים מתמידים בפרות החלב בתקופה שלאחר ההמלטה. הדוח הוגש באוגוסט 2010.

ניסוי  2 (שנה ב): השראת ציסטות באמצעות ACTH על מנת לאפיין שינויים ברמות ההורמונים ובביטוי גנים בזקיק המתפתח.

    על מנת לעקוב אחרי התפתחות ציסטות נקטנו בגישה מבוססת על הזרקות חוזרות של ההורמוןAdrenocorticotropic Hormone (ACTH)  אשר מגרה את בלוטת יותרת הכליה להפריש קורטיזול ופרוגסטרון. טיפול זה מדמה מצב של עקה בו ריכוזי הקורטיזול והפרוגסטרון ממקור של יותרת הכליה עולים, בעקבות כך מתעכבת הפרשת ה- LH מההיפופיזה. הצלחת הטיפול המתואר, לצורך השראת ציסטות, עומד על כ- 80% מהפרות המטופלות כ- 9 ימים מתחילת הטיפול .

חומרים ושיטות

1. חיות הניסוי: ניסוי זה כלל 8 פרות בוגרות (המלטה ראשונה ומעלה) אשר היו מיועדות ליציאה מהעדר בשל בעיות רגליים, תנובה ומבנה עטין אך מחזוריות ובעלות מערכת מין תקינה. הפרות שוכנו בסככות פתוחות, נחלבו שלוש פעמים ביום והוזנו במנה כולית סטנדרטית שתוארה קודם. זיהוי הפרות ומעקב אחר תנובת החלב ומרכיביו התבצעו בעת חליבה באמצעות תג רגל אלקטרוני (צ.ח.מ. אפיקים, ישראל).

2. מהלך הניסוי: פרות הניסוי סונכרנו באמצעות הזרקת PG ו- 48 שעות לאחריה הזרקה נוספת של GnRH. יום ההזרקה של GnRH נרשם כיום אפס למחזור הייחום. התרחשות הביוץ אומתה על ידי סריקות אולטרה-סאונד בימים 2-3 למחזור הייחום. הפרות חולקו באופן אקראי לשתי קבוצות: קבוצת ביקורת וקבוצת טיפול (ACTH). פרוטוקול הניסוי המקורי כלל, בקבוצת הביקורת, הזרקת PG  ביום 15 למחזור הייחום ואיסוף השחלות בבית המטבחיים 40 שעות לאחר מכן, לקבלת זקיק קדם ביוצי מגל שני (איור 1A). נציין כי בשל מגבלות תאום שחיטה, נאלצנו להמשיך בסנכרון פרות קבוצת הביקורת באמצעות הזרקה נוספת של  GnRHומנת PG נוספת 6 ימים מאוחר יותר. כך שבפועל ביום השחיטה, נאספו מקבוצת הביקורת זקיקים קדם ביוציים מגל ראשון (איור B1). קבוצת הטיפול עברו השראה לעקה במהלך התפתחות הזקיק הדומיננטי מגל שני, באמצעות הזרקת ACTH במשך 7 ימים כל 12 שעות, החל מיום 15 למחזור הייחום (איור 1C ).

הנוזל הפוליקולרי נשאב באמצעות מזרק ודגימה מדופן הזקיק נלקחה והוקפאה בחנקן נוזלי לצורך הפקתmRNA. דגימה נוספת נלקחה לצביעה היסטולוגית. ריכוזי ההורמונים בנוזל הפוליקולרי נבדקו עבור כל הזקיקים הגדולים שנמצאו בזמן השחיטה על פני השחלה וזאת על מנת לאתר את הזקיק הדומיננטי אשר אובחן קודם לכן בסריקות האולטרה-סאונד. על פי פרוטוקול הניסוי, הזקיק הנבחן בקבוצת הטיפול הוא הזקיק הדומיננטי.

4 . אפיון הורמונאלי:

אפיון הפרופיל ההורמונאלי בפלזמה ובנוזלים הפוליקולריים נעשה בשיטת radioimmunoassay (RIA).  ריכוזאסטרדיול בנוזל הפוליקולרי נקבע באמצעות ultra-sensitive RIA kit (DSL-4800 Diagnostic Systems Laboratories inc., Webster, Texas, USA), בהתאם להוראות היצרן. אנדרוסטינדיון בנוזל הפוליקולרי נקבע באמצעות Androstenedione RIA kit (DSL-4200, Diagnostic Systems Laboratories inc.,Webster, Texas, USA), בהתאם להוראות היצרן.

ריכוזי פרוגסטרון נמדדו בפלזמה ובנוזל הפוליקולרי באמצעות solid-phase RIA kit (coat-a-count progesterone, Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles, California, USA), כנגד עקומת כיול אשר הוכנה באמצעות פלזמה של פרה כרותת שחלות. ריכוזי קורטיזול נמדדו בפלזמה באמצעותsolid-phase RIA kit (coat-a-count cortisol, Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles, California, USA), בהתאם להוראות היצרן.

קביעת ריכוז אינסולין בפלזמה ובנוזל הפוליקולרי נעשו באמצעות solid-phase RIA kit, בהתאם להוראות היצרן. רגישות המבחן היא: 120pg/ml, כאשר השונות בתוך ובין המבחנים הייתה: 3.6% ו-,3.8% בהתאמה.

5. סנכרון ייחומים:

סנכרון ייחומים התבצע באמצעות הזרקה תוך שרירית של 2ml אנלוג ל-Prostaglandin F_2α (PG ; Cloprostenol Estroplan injection, Parnell Laboratories, Sydney, Australia) לניוון הגוף הצהוב ולאפשר התפתחות של זקיק קדם ביוצי. 48 שעות לאחר הזרקת ה- PG ניתנה זריקה של 2.5 ml אנאלוג ל-Gonadotrophin Releasing Hormone (GnRH; Gonadorelin, Parnell Laboratories, Sydney, Australia) על מנת להשרות ביוץ של הזקיק הדומיננטי. יום הזרקת ה- GnRH נרשם כיום אפס למחזור. במהלך סנכרון הייחומים נעשה מעקב באמצעות אולטרה-סאונד כדי לוודא שהפרות מגיבות לטיפול. כמו כן, לוודא התרחשות של ביוץ בימים 2-3 למחזור הייחום.

6. השראת ציסטות באמצעות :ACTH.

 הפרות טופלו באנלוג ל-Adrenocorticotropic Hormone (ACTH 1ml; Tetracosactide hexaacetate,Synacthen^® depot, Novartis Pharma, Basel, Switzerland) אשר הוזרק תת עורית במשך 7 ימים (מיום 15 עד יום 21 למחזור) ובתדירות של פעמיים ביום. השחלות נאספו בבית המטבחיים ביום 23 למחזור על מנת לבחון את השפעת הטיפול על הזקיק המתפתח. זקיקים קדם ביוצים שנלקחו מפרות מסונכרנות אך לא מטופלות, שימשו כקבוצת הביקורת.   

איור 1: תאור סכמטי של מהלך ניסוי מספר 2ב': השריית ציסטות באמצעות ACTH על מנת לאפיין שינויים ברמות ההורמונים, בזרימת הדם ובביטוי גנים בזקיק המתפתח. ov– מציין התרחשות ביוץ. (A) מהלך הניסוי המתוכנן עבור קבוצת הביקורת, כולל איסוף זקיק קדם ביוצי מגל שני. (B) מהלך הניסוי בפועל עבור קבוצת הביקורת, כולל סנכרון ייחומים נוסף ואיסוף זקיק קדם ביוצי מגל ראשון. (C) מהלך הניסוי  עבור קבוצת הטיפול (ACTH כל 12 שעות במשך 7 ימים).

7. הפקת total RNA וביצוע :Semi-quantitative PCR

. הפקת total RNA מכל דוגמה נערכה באמצעות הריאגנטTrizole (1ml; Invitrogen, Carsdad,

ריאקצית ה- Reverse Transcription נעשתה באמצעות האנזיםM-MLV Reverse Transcriptase(Promega, Madison, Wisconsin, USA). בשלב ראשון, (72°C למשך 10 דקות)  הוסף התחל Oligo-dT(1µl; Sigma-Genosys) ל- 1000ng total RNA על מנת לאפשר סינתזה של גדיל משלים בשלב הבא. לאחר הצמדות ההתחלים, הוספה תערובת שהכילה 5X RT buffer (4μl), RRI (40U/µl;1µl),  10mM dNTPsmix (1.5µl) והאנזים M-MLV (200U/µl; 1µl) בנפח סופי של 20µl. בהמשך נעשתה הדגרה למשך שעה ב- 42°C ולאחריה הדגרה נוספת בטמפרטורה של 10°C למשך 2 דקות. ה- cDNA שהופק נשמר ב--20°C עד להמשך עבודה.

הגברת מקטעי ה- DNA בגנים הנבחרים נעשתה באמצעות תחלים ייחודיים לכל גן שתוכננו במעבדה באמצעות תוכנת Primer express^T.M 2.0 וסונתזו בחברת Sigma (Genosys) (טבלה 1), התחלים לאיזומרים של הגן VEGF תוכננו על ידי Garrido וחובריו (1993) ואושרו לשימוש בשחלות בקר על ידיBerisha וחובריו (2000). ריאקצית הגברה למקטע cDNA נעשתה בנפח סופי של 25µl. תערובת הריאקציה כללה תבנית,cDNA  שני סוגי תחלים (Forward/Reverse) בריכוז 10µM כל אחד ו- PCR Master Mix(Promega, Madison, Wisconsin, USA) הכולל dNTPs, MgCl₂, Taq DNA- Polymerase, בופרים מתאימים ו- DDW להשלמת הנפח. המבחנות הועברו למכשיר ה- PCR (TProfessional Standard, Biometra, Gottingen, Germany).

מחזורי ה-PCR  כללו (1) דנטורציה: 5 דקות ב- 95°C, (2) דנטורציה:  30שניות ב- 95°C, (3) Annealing:30 שניות ב- 55°C, (4) Extension: 30 שניות ב- 72°C, (5) 30 מחזורים משלב 2 ועד שלב 4, לבסוף (6)Final extension: 10 דקות ב- 72°C.  תוצרי ה- PCR הורצו בג'ל אגרוז בריכוז 1.5% שהכיל אטידיום ברומיד (0.5-1µg/ml) וצולמו  תחת V.U. גודל מקטע ה- DNA שהתקבל הושווה לאלו המתקבלים בסמן100bp DNA Ladder.

תוצאות

נתוני פרות הניסוי מוצגים בטבלה 1. ניתן לראות כי לא היו הבדלים מובהקים בין קבוצת הביקורת לקבוצה שטופלה ב- ,ACTH בפרמטרים הבאים: מספר התחלובה, ימים בתחלובה ותנובת חלב יומית ממוצעת בתחילת הניסוי.

טבלה1: השוואה של נתוני הפרות בקבוצות הניסוי השונות, בתחילת הניסוי.

3 מתוך 4 פרות הגיבו לטיפול ב- ACTH. ריכוז הקורטיזול בפלזמת פרות שטופלו ב- ACTH היה גבוה פי 10מזה שהתקבל לפני הטיפול. בנוסף התקבלה ירידה משמעותית וחדה בתנובת החלב בפרות המטופלות לאורך כל תקופת הניסוי. על מנת לבטל את השונות בין הפרות חושב השינוי בתנובת כל פרה כאחוז מהתנובה שנרשמה ביום תחילת הניסוי. בתום הניסוי נמצא כי פרות הטיפול הניבו כ- 40% מתנובת החלב שנרשמה בתחילת הניסוי (איור 2). פרות הביקורת הראו רמת הנבה קבועה. בתום הניסוי נאספו 3 ציסטות מושרת ו- 5זקיקים גדולים נוספים. 

שתי פרות מקבוצת הביקורת הוצאו מהניסוי בשל אי תגובה לסנכרון (פרה מספר 2902) ותחלואה (פרה מספר3014) המלווה בשלשול חמור, חום גוף גבוה (40°C), ירידה של 54% מתנובת החלב ועליה בריכוז הקורטיזול בפלזמה. בתום הניסוי נאספו 3 זקיקים דומיננטיים מקבוצת הביקורת (בפרה אחת נצפתה דומיננטיות משותפת; טבלה2) אשר שימשו בניתוח הסטטיסטי.

איור 2: תגובת הפרות לטיפול ב- ACTH– ריכוז הקורטיזול (ng/ml) בפלזמת פרות הביקורת (n=2, קו רציף) לעומת פרות שטופל ב- ACTH (n=3, קו מקוטע) כפי שנבחן בשלושה מועדים:לפני תחילת הטיפול, באמצעו ובסוף התקופה. הנתונים מוצגים כ- Mean ± SEM.  ∗ מציין רמת מובהקות של P<0.05.  

איור 3: תגובת הפרות לטיפול ב- ACTH– תנובת החלב היומית, מוצגת כאחוז מהתנובה ביום תחילת הניסוי. פרות הביקורת (n=2,  קו רציף) לעומת פרות שטופלו ב- ACTH (n=3, קו מקוטע). הזרקות ACTH התבצעו בימים 19-25 לניסוי. הנתונים מוצגים כ- Mean ± SEM. ∗ מציין רמת מובהקות של P<0.05.  

טבלה 2: מאפייני הזקיקים הגדולים בפרות הניסוי.

אפיון הזקיקים הגדולים בשחלות: קבוצת הטיפול התאפיינה בגדילה של יותר מזקיק גדול אחד בשחלה (טבלה2). אפיון אשר יכול להעיד על העדר דומיננטיות פונקציונאלית, ככל הנראה עקב ייצור אסטרדיול נמוך על ידי הזקיק (טבלה 3). לעומת זאת, קבוצת הביקורת התאפיינה בנוכחות זקיק גדול בודד אשר זוהה בהמשך כזקיק דומיננטי. בפרה אחת התקבלה

פרופיל הורמונאלי בפלזמה ובנוזל הפוליקולרי: תבנית הירידה של הפרוגסטרון בפלזמה בפרות אשר טופלו ב- ACTH התאפיינה בדעיכה מתונה אשר נמשכה לאורך תקופת הטיפול ולאחריה . לא נצפתה ירידה מהירה בריכוזי הפרוגסטרון בפלזמה המאפיינת תום פאזה לותאלית במהלך מחזור תקין. לעומת זאת, בקבוצת הביקורת, ריכוזי הפרוגסטרון בפלזמה היו גבוהים, בנוכחות גוף צהוב, וירדו באופן מהיר בעקבות ניוון הגוף הצהוב באמצעות הזרקת אנלוג ל- PG.

4 איור

 מציג את ריכוזי האינסולין בפלזמת הפרות אשר נמדדו לאורך כל תקופת הניסוי. ניתן להתרשם כי ריכוזי האינסולין בפלזמת הפרות היו נמוכים לפני תחילת הטיפול (ימים 1-20 לניסוי) בשתי הקבוצות. עד תחילת הטיפול ב-ACTH (יום 20 לניסוי) נמדדה עליה בריכוז האינסולין בקבוצת הטיפול, אשר הגיעה לשיא ביום  24לניסוי ונשארה גבוה עד יום 27 לניסוי.  לעומת זאת, פרות הביקורת שמרו על ריכוזי אינסולין נמוכים קבועים לכל אורך תקופת הניסוי. ניתן להתרשם מהשונות הרבה בין הפרות בתוך י

ניתן לראות כי במהלך הטיפול הייתה עליה ממוצעת של פי 3.8 בריכוז האינסולין בפלזמת פרות הטיפול. לעומת זאת, ריכוז האינסולין בפלזמת פרות הביקורת היה זהה לחלוטין בשתי התקופות. יש לציין כי לפני תחילת הניסוי ריכוז האינסולין הממוצע בתקופה זו היה גבוה יותר בפרות הטיפול מאשר בפרות הביקורת.

איור5: ריכוזי האינסולין (ng/ml) בפלזמת פרות הביקורת (n=2, קו רציף) ובפלזמת פרות הטיפול (n=3, קו מקוטע). ACTH– (1mg) הזרקה תת-עורית כל 12 שעות בימים 20 עד26 לניסוי. הנתונים מוצגים כ- Mean ±SEM. ∗ מציין רמת מובהקות של P<0.05

טבלה3: ממוצע ריכוז אינסולין בפלזמה בתקופה שלפני (ימים 1-20), במהלך ולאחר (ימים 21-28) הטיפול.

טבלה 4: ריכוז ההורמונים בנוזל פוליקולרי של זקיקים דומיננטיים שנאספו מפרות הביקורת (n=3) וזקיקים שנאספו מפרות הטיפול (ACTH; n=3).

שינוי ברמת ביטוי גנים: רמת הביטוי של גנים המעורבים בתהליכי הסטרואידוגנזה נבחנה תוך שימוש ב-GAPDH כגן ביקורת אשר רמת ביטויו נמצאה זהה ויציבה בכל הדוגמאות שנבחנו.

בעקבות הטיפול ב- ACTH התקבלו שינויים ברמת ביטוי ה- mRNA של מספר גנים המעורבים בתהליך הסטרואידוגנזה. רמת הביטוי של הגנים LHr, 3β-HSD ו- P450_arom הייתה נמוכה יותר (P<0.05) בזקיקי פרות הטיפול בהשוואה לפרות הביקורת. בנוסף, רמת הביטוי של הגן P450_c17 הייתה נמוכה יותר אך ברמת מובהקות של P<0.06. גם רמת הביטוי של הגנים StAR ו- P450_scc הייתה נמוכה יותר בקבוצת הטיפול לעומת הביקורת אם כי שיעור הירידה לא נמצא מובהק .

תמונה: תוצאות הרצה בג'ל אלקטרופורזה- רמת ביטוי ה- mRNA של גנים המעורבים בתהליך הסטרואידוגנזה בזקיקים גדולים,  מפרות קבוצת הטיפול (ACTH) וקבוצת הביקורת.

דיון

בהתבסס על ממצאי העבודה הנוכחית ניתן להציע מנגנון אפשרי להתפתחות והתמדת ציסטה שחלתית וזקיק מתמיד בתקופה שלאחר ההמלטה. אנו סבורים כי רגישות שונה לעקה סביב ההמלטה היא בבסיס התהליך. תנאי העקה המלווים את ראשית התחלובה יכולים לגרום לירידה ברמת ביטוי גנים המעורבים בסטרואידוגנזה בזקיק הדומיננטי בדומה לזו שהתקבלה למרות העובדה כי הפרות בהן התפתחה פתולוגיה שחלתי (ציסטה או זקיק מתמיד) לא נבדלו בתנובת החלב, מצב גופני ומחלות רחם מפרות בהן התפתח זקיק דומיננטי/קדם ביוצי,בעקבות השראת עקה באמצעות .ACTH שינויים מעין אלו יכולים להוביל לירידה בסינתזת האסטרדיול בזקיק כפי שנמצא בנוזלים פוליקולרים של זקיקים סביב מועד היווצרות הציסטה, כמו גם ביכולת הפרשתו לפלסמה (לא נבדק בעבודה זו). הפרשת אסטרדיול ברמות סף נמוכות יכולות לפגוע בשרשרת האירועים המובילה לביוץ ובכלל זה שינוי פולסטיליות ה- LH, הפרשת שיא אסטרדיול, שינוי דפוס הפרשת ה-GnRH ושיא LH.  שיבוש במנגנון מורכב זה  יכול לגרום לכשל ביוצי ולהתפתחות של ציסטה שחלתית פעילה או זקיק מתמיד. אנו סבורים כי בתקופה שלאחר ההמלטה התפתחות ציסטות קשורה לפגיעה בסינתזת והפרשת האסטרדיול המובילה לשיבוש "הדיאלוג" בין האסטרדיול ל- LH ולכשל ביוצי ולא לרמות פרוגסטרון תת-לותאליות, אם כי רמות פרוגסטרון נמוכות מתקשרות להתמדת הזקיק ועיכוב בחידוש מחזוריות תקינה. 

בהעדר גוף צהוב פעיל רמות הפרוגסטרון בפלזמה לאחר ההמלטה לא ניתנות לאבחון. מצב זה מאפיין הן פרות אשר חידשו מחזור ייחום תקין (התפתח זקיק קדם ביוצי מבייץ), והן בפרות בהן התפתחה פתולוגיה שחלתית כך שרמות הפרוגסטרון כשלעצמן אינן הגורם הראשוני. במצבים בהם מתפתחת ציסטה לותאלית המפרישה פרוגסטרון, מתקבלים ריכוזים תת-לותאלים של פרוגסטרון בפלזמה כך שנוצרת סביבה הורמונאלית המאפשרת התמדה של זקיקים. בשל רמות פרוגסטרון נמוכות ובהעדר עיכוב של פרוגסטרון על ההפרשה הפולסטילית של GnRH מתאפשר שחרור פולסטילי של LH התומך בגדילה ותפקודו של הזקיק הדומיננטי ללא ביוץ. במקרים אלה חידוש מחזור ייחום תקין מתאפשר רק לאחר ירידה בריכוזי הפרוגסטרון בפלזמה.

שימוש במודל על מנת ליצור שיבוש בציר היפותלמוס-היפופיזה-שחלה, הראה כי הפגיעה ביכולת הסטרואידוגנית של הזקיק הדומיננטי וירידה בריכוזי ההורמונים בנוזלים הפוליקולריים לוותה בירידה ברמת הביטוי של מספר גנים וחלבונים המשתתפים בתהליך הסטרואידוגנזה וחשובים להתפתחות הזקיק.