השתלת עוברים in-vitro ככלי לשיפור פוריות הקיץ הנמוכה של פרות חלב

א. ערב, צ. רוט, י.זרון

מבוא

הירידה בביצועי הפוריות במהלך חמישים השנים האחרונות היא אחת הבעיות העיקריות המעסיקות את משק הבקר לחלב בארץ ובעולם. אחד הגורמים העיקריים לירידה בפוריות הוא רגישות פרת החלב לעומס חום. טיפוח רב שנים לייצור גבוה של חלב ומנגנון פיסיולוגי מוגבל לפינוי עודפי האנרגיה הנוצרת במהלך ייצור החלב,  הופכים את פרת החלב לבעל חיים רגיש במיוחד. ואכן בעקבות עליה בטמפרטורת הסביבה מפתחת הפרה בנקל היפרטרמיה ובעקבות כך מתקבלת פגיעה בביצועי הפוריות. שיעורי התעברות נמוכים במשך מספר חודשים בשנה (יוני-אוקטובר) גורמים לפגיעה כלכלית כבדה בענף כולו.
שיעור ההתעברות להזרעה בישראל יורד מ 38% בחודשי השנה הקרים ל 11% בחודשי הקיץ.
השיטה הרווחת כיום להקטנת השפעת  עומס החום היא  צינון תכוף של הפרות והגדלת שטחי ההצללה.
שיטה זו אינה מספקת, ויש לפתח שיטות נוספות שיבואו וישלימו את השיטה הקיימת להורדת השפעת עומס החום ועליית הפוריות ושיעור ההתעברות בחודשי הקיץ.
אחת הגישות היא העלאת שיעור ההתעברות על ידי תוכנית העברת עוברים (1).
כידוע, הביציות הן הראשונות להיפגע בחשיפה לעומס חום ולכן הפוריות ושיעור ההתעברות יורדים בחודשי הקיץ. לכן, במהלך חודשי החורף גודלו ונאספו (3,4) עוברים שהופקו מביציות איכותיות וביום 7 (שלב הבלסטוציסט) הוקפאו ונשמרו בחנקן נוזלי  עד הקיץ. בחודשי הקיץ הופשרו והועברו לרחם הפרה ביום 7-8 לאחר הייחום וכך נמנעה השפעת עומס החום על הביציות כיון שרק העוברים שנוצרו מביציות חורף הועברו בחודשי הקיץ והם אלו שיובילו לעליה בפוריות ושיעור ההריונות בחודשי הקיץ. שימור העוברים בין עונות השנה נעשה בשיטת הזיגוג  ( Vitrification- שינוי המצב הפיזיקלי של החומר ללא יצירת גבישים) בה נמנעת יצירת גבישים אשר פוגעים בתא ומאפשרת הורדת  ריכוז חומרי השימור אשר מעלים את  האוסמולריות בתוך התא וגורמת להרעלתו.
שילוב של ביציות חורף איכותיות, גידול העוברים ושימורם בשיטת הזיגוג תהווה אסטרטגיה חדשה להעלאת פוריות הקיץ במשק החלב בישראל (2).

מטרות

העלאת הפוריות ושיעור ההתעברות בפרות/מבכירות שנחשפו לעומס חום על ידי תוכנית שימור והעברת עוברים

חומרים ושיטות

1. מודל הניסוי
במהלך חודשי החורף נאספו ביציות והופרו. העוברים גודלו  in vitro   עד שלב הבלסטוציסט (n=200 ) ונשמרו בחנקן נוזלי. בחודשי הקיץ הופשרו העוברים והועברו לפרות אומנות שנחשפו לעומס חום (n=50). קבוצת הביקורת הופשרה בחודשי החורף והעוברים הועברו לפרות אומנות (n=50 ).

2. איסוף ביציות
א. במהלך חודשי החורף נאספו שחלות מבתי מטבחיים.
ב. השחלות הובלו למעבדה בתמיסת saline    בטמפרטורה של C°37.
ג. השחלות נחצו לשתיים בעזרת סכין מנתחים ונשטפו פעמיים בתמיסת saline.
ד. הביציות נשאבו מהזקיקים הגדולים 3-8mm בעזרת מחט  18g  אל תוך תמיסת HEPES-TALP.
ה. הביציות עברו הבגרה בתמיסת 199TCM למשך 22 שעות באינקובטור בתנאים של C°38.4  , 5%     CO2 ולחות יחסית של 95%.

3. הפריה וגידול עוברים
א. ביציות שעברו הבגרה הופרו בזירמה קפואה (פר פציל) והועברו לגידול.
ב. העוברים גודלו בטיפות  בנפח50µl  של תמיסת Sydney IVF cleavage medium  כעשרה עוברים בטיפה מכוסים בשמן מינרלי. בתנאים של C°38.4  , 5%     CO2 ולחות יחסית של 95% במשך כ 20 שעות.
ג. לאחר מכן הועברו העוברים לטיפות  בנפח  50µl  של תמיסת Sydney IVF blastocyst medium  , כעשרה עוברים בטיפה מכוסים בשמן מינרלי. בתנאים של C°38.4  , 5%     CO2  O2 5%, ולחות יחסית של  95% לגידול באינקובטור במשך 6 ימים עד הגעת העובר לשלב הבלסטוציסט.

4. שימור –שיטת הזיגוג (= ויטריפיקציה)
א. העוברים נבחנו מורפולוגית ורק העוברים האיכותיים בשלב הבלסטוציסט עברו ויטריפיקציה.
ב. העוברים עברו דרך שלוש תמיסות זיגוג (VS) בריכוזים עולים VS10% למשך 3 דקות נשטפו ב VS50% ומידה לתמיסה הסופית VS87.5%  (VS100% מכיל 38% אתילן גליקול, M0.5 טריהלוז 6% אלבומין מסרום בקר בתמיסת PBS ).
ג. העוברים הועברו בנפח קטן לקשית SOPS שנאטמה בחום בצד הצר ובפקק זיהוי מצידה הרחב.
ד. מיד לאחר הטענת העוברים ואטימתם, הקשית הוכנסה  לחנקן נוזלי שקורר בעזרת מכשיר הויטמאסטר ל( C°208 -) להעלאת קצב הקירור.
ה. לאחר מכן הועברו הקשיות לאחסון במיכל חנקן נוזלי על להפשרה.

5. הפשרה-
א. הפשרת הקשיות נעשתה על ידי חשיפתן באוויר למשך שנייה ולאחר מכן הכנסתם תמיסת אלכוהול 70% מחוממת ל C°38 למשך כ 20 שניות.
ב. פקק הזיהוי הוסרה והקצה המולחם נקטם.
ג. העוברים הועברו מהקשית לתמיסת הפשרה ( M0.6 בתמיסת PBS ) למשך 4 דקות ולאחריהן לתמיסות בריכוזים יורדים M0.5, M0.4, M0.3, M0.2, M0.1 ו PBS למשך 2 דקות בכל שלב.
ד. העוברים הועברו לתמיסת Holding Solution    ונשטפו פעמיים.
ה. העוברים נטענו לקשית 0.25ml  לצורך העברה לרחם.

6. סינכרון פרות
א. פרות/ מבכירות לאחר ימי הריק סונכרנו על ידי מתן (PGF2α )   Prostaglandin F2α  תוך שרירי במינון של 2.5ml.
ב.  14 יום מאוחר יותר קבלו זריקה נוספת של  PGF2α  במינון של 2.5ml.
ג. 21 יום לאחר מתן הזריקה השנייה בוצעה תצפית דרישות ויום הדרישה הוגדר כיום האפס ( 0d  ).

7. העברת עוברים
א. ביום 7-8    (  d 7-8 )  אחר הדרישה הופשרו העוברים ונבחנו מורפולוגית. רק עוברים איכותיים נטענו בקשיות לצורך העברה.
ב. קיום גוף צהוב נבדק בשחלות פרות/ מבכירות ולקרן הרחם המתאימה יועבר העובר.

8. בדיקות
א. 5 ימים לפני ההשתלה ו 6 ימים לאחר ההשתלה נלקח דם מהפרות לצורך בדיקת רמות פרוגסטרון
35  ימים לאחר ההשתלה בוצעה בדיקת הריון ע"י וטרינר מקומי

9. משקים להעברת עוברים

10. תפקידים ואחריות
א. מעבדה מרכזת – דר' אמיר ערב, איציק דקל – מכון וולקני
ב. איסוף שחלות – איציק דקל – מכון וולקני
ג. גידול עוברים – איציק דקל , אולגה שניאורסון – מכון וולקני
ד. שימור עוברים – סער יבין, אולגה שניאורסון – מכון וולקני
ה. הפשרת עוברים- סער יבין– מכון וולקני
ו. סנכרון פרות בחורף סה"כ 13 פרות בפועל
.i גבעת חיים מאוחד – אורנה 7 פרות
.ii גבעת חיים איחוד – דני 6 פרות
ז. סינכרון פרות בקיץ סה"כ 66 פרות בפועל
i. גבעת חיים מאוחד – אורנה 9 פרות
ii. גבעת חיים איחוד דני – 7 פרות
iii. אביגדור – ריינהולד אריה 7 פרות
iv. אביגדור  – ריינהולד דני 11 פרות
v. אביגדור  – כהן רוני 8 פרות
vi. באר טוביה – הורוביץ 5 פרות
vii. באר טוביה – רותם 11 פרות
viii. באר טוביה – יעקבי 8 פרות
ח.  העברת עוברים – דוד דיטשיים – שיאון
ט. לקיחת דמים  ואנליזת פרוגסטרון – חיים גסיטוע – מכון וולקני
י. בדיקות הריון- וטרינר מקומי של כל משק

תוצאות
א. השתלות והמלטות

במהלך חודשים ינואר עד מאי  הופקו ביציות משחלות שהובאו מבתי המטבחיים. הפרייתם היתה עם זרע של הפר פציל בלבד. כ 100 עוברים בשלב הבלסטוציסט הוקפאו בשיטת הזיגוג ונשמרו בחנקן נוזלי עד למועד השתלתם.
השתלת העוברים בחורף (טבלה מס' 1) בוצעה בקנה מידה קטן ורק לאחר שנוכחנו בצבירת מספיק עוברים להשתלות בקיץ. בחודשים אפריל ותחילת מאי  לפני תחילת ההתחממות של הקיץ הוכנו על פי הפרוטוקול 13 פרות מבכירות ועגלות. כולן נמצאו מתאימות להשתלה על סמך זיהוי התנהגותי של יחום ופלפציה של השחלות (לזיהוי גוף צהוב תקין אחד לפחות על פני אחת השחלות). הושתלו 13 פרות ועגלים בעמק חפר (גבעת חיים איחוד ומאוחד). בכל החיות שסונכרנו לקראת ההשתלה נצפה גוף צהוב והתאמה להשתלה כלומר תגובה חיובית לטיפול ההורמונלי. התקבלו 2 הריונות תקינים, בעגלה ובמבכירה אחת. המלטה אחת  היתה מוצלחת ושניה הסתימה במות העגל בגלל המלטה ממושכת מדי ובמצב עכוז.
השתלות העוברים בקיץ בחורף (טבלה מס' 1) בוצעו במהלך חודשים ספטמבר ואוקטובר  כאשר עומס החום עדיין גבוה (בתאריכים 11/9,10/9, 20/9 ,25/10) במספר משקים באזור קרית גת (מושב אביגדור ובאר טוביה) ובעמק חפר (גבעת חיים איחוד ומאוחד). רק 40 מתוך 66 פרות מבכירות ועגלות שהוכנו נמצאו מתאימות להשתלה על סמך זיהוי התנהגותי של יחום ופלפציה של השחלות ומציאת גוף צהוב תקין אחד לפחות  (בגיל המתאים לביוץ המבוקר) על פני אחת השחלות.
הפשרת העוברים הקפואים נעשתה ביום ההשתלה וסמוך למקום.  עוברים שנבחרו להשתלה היו בעלי Zona Pelucida שלמה והראו סימני התאוששות חלל הבלסטוציסט (Blastocoel) בקצב תקין לאחר ההפשרה. בד"כ הופשרו פי שניים עוברים ממספר הפרות המועמדות להשתלה כדי לאפשר בחירת הטובים ביותר מבחינה מורפולוגית.
השתלת העוברים נעשתה תמיד ע"י החדרת עובר יחיד לפרה.

טבלה מס' 1: פרופיל קבוצת הפרות המושתלות לפי עונת השתלת עוברים

ב. פרופיל הורמונלי בדם

בדיקת כמות הפרוגסטרון בדם ביום 5- וביום 6+ יחסית ליום לפני ההשתלה מאפשרת א. בקורת פנימית שהגוף הצהוב אותו מודא המשתיל טרם ההשתלה אכן תקין מבחינה הורמונלית ב. ללמוד על תגובת החיות לסנכרון ההורמונלי טרם ההשתלה ועל כן על מוכנותם לקלוט את העובר המושתל. אין אפשרות ללמוד בימים אלה על קליטת העובר בפועל ועל תחילת הריון.
בדיקת רמת הפרוגסטרון בכל החיות שהושתלו בחורף ובמדגם מהחיות שהושתלו בקיץ מלמדת על מספר פרופילים שונים אפשריים שצפויים:
א. פרות עם רמה גבוהה של פרוגסטרון בגלל שבייצו והחלו לפתח גוף צהוב
ב. פרות שאינן מחזוריות רגילות ולא מגיבות כלל לטיפול ההורמונלי במועדים הצפויים.
ביום 6+ היתה רמה גבוהה של פרוגסטרון בחלק מן המושתלות בגלל גוף צהוב שהתפתח לאחר זריקה שניה. בחלק אחר לא התפתח גוף צהוב ועל כן הרמה הנמוכה

טבלה מס' 2: תוצאות בדיקת כמות פרוגסטרון בדם:

כאמור התקבלו 2 הריונות בחורף ו-3 הריונות בקיץ (ראה טבלה מס' 3). כל ההריונות היו תקינים.

טבלה מס' 3: המלטות לאחר השתלה בקיץ ובחורף

דיון

תכנית השימור והעברת העוברים לפרות ומבכירות בשיא עומס החום שבקיץ 2006 הביאה להריונות והמלטות דוקא בקבוצה קטנה של עגלות שצורפה לניסוי. והרי ידוע שעגלות אינן סובלות מעומס חום.
חלק מן הפרות והמבכירות שהושתלו הראו רמת פרוגסטרון בדמם ברמה גבוהה יחסית – דבר המצביע על התפתחות גוף צהוב ובכל זאת לא נקבע הריון באף אחת מהן לאחר 35 ימים ע"י בדיקה וטרינרית. יש בממצאים אלה להצביע לראשונה על היתכנות השיטה שכוללת שימור העובר לאחר הקפאה בשיטת הזיגוג והשתלתו בעגלות אך אין בכל זה מספיק כדי לקבל הריונות בפרות ומבכירות הנמצאות בעומס חום. כלומר שלמרות שהושתל "עובר חורף" ב"פרת קיץ"  – לא התקבל הריון! דומה שמצב הפרה/מבכירה עתירת התנובה בקיץ אינו מאפשר הריון במערכת הניסוי הנוכחית בעוד שבעגלות המצב שונה לחלוטין עם 50% הריונות.
מסקנות סופיות מאסטרטגיה זו של העברת עוברים איכותיים, שימורם בשיטת הזיגוג והשתלתם בפרות ומבכירות  יש להסיק בקבוצות ניסוי גדולות יותר ועם אחידות גדולה יותר בתוך כל קבוצה מאחר ובניסוי הנוכחי היו מעורבים הרבה משקים שונים באזורים שונים בארץ ובכל אחד מספר קטן יחסית של פרות. חלקם נתנו לטובת הניסוי פרות עם הסטוריה של הרבה הזרעות קודמות שליליות ואולי סיכויי התעברות נמוכים מלכתחילה.
בעתיד ננסה לבדוק שיפור אחוזי הריונות ע"י השתלת עובר  פרתנוגנטי בפרות שהוזרעו שבוע קודם לכן.עובר כזה אינו מסוגל להקלט אך מסוגל לתמוך בעובר נוסף לתקופה קצרה.

מקורות ספרות

1. Franco, M., Block, J., Jousan, F.D., de Castro e Paula, L.A., Brad, A., Franco, J.M., Grisel, F., Monson, R.L., Rutledge, J.J., and Hansen, P.J. (2006) Effect of transfer of one or two embryos and administration of gonadotropin releasing hormone on pregnancy rates of heat-stressed dairy cattle . Theriogenology, 66, 224-233.
2. Hansen, P.J. (2006) Embryo transfer as a tool for fertility enhancement of dairy cattle in hot climates. Acta Sci. Vet., 34 (Suppl. 1), 145-157 (also in Portuguese, same citation).
3. Parrish JJ, Susko-Parrish JL, Critser ES, Eyestone WH, First NL. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology 1986; 25:591-600
4. Xu KP, Yadav BR, Rorie RW, Plante L, Betteridge KJ, King WA. Development and viability of bovine embryos derived from oocytes matured and fertilized in vitro (italcis) and co-cultured with bovine oviductal epithelial cells.  J Reprod Fertil 1992; 94:33-43.