השפעת רקמת השומן של בלוטת החלב על הפוטנציאל הלקטוגני של הפרה החולבת

השפעת רקמת השומן של בלוטת החלב על הפוטנציאל הלקטוגני של הפרה החולבת

תקציר
בעבודה זו שנעשתה הן בתרביות רקמה ותאים והן בחיה השלמה הראינו את חשיבות רקמת השומן ביצור חלבוני חלב על ידי התאים האפיתליאליים במעבדה. בחיה השלמה הראנו בברור את השפעת גידול העגלות מהמלטה ועד גמילה (6-7 שבועות) בחלב מלא שהביא ליצור חלב של 30.4 קג'\יום לעומת עגלות הביקרת 29.4 קג'\יום במבכירות.

2. מבוא:
בלוטת החלב משמשת ביונקים כמכשיר להזנת הוולד ע"י יצור חלב והפרשתו. התאמת בלוטת החלב לצרכים אלו נעשית עלי ידי גדילה והתמיינות לקראת המלטה והתנוונות לאחר גמילת הצאצאים או לחילופין הפסקת החליבה בבקר. שלושה הורמונים עיקרים חיוניים להתפתחות תקינה של רקמת העטין, פרולקטין, אינסולין וקורטיזול. הורמונים אלו מעורבים בשני השלבים עיקרים בהתפתחות התאים המפרישים בבלוטת החלב, שלב הפרוליפרציה ושלב הדיפרנציאציה. בשלב הפרוליפרציה תאי גזע (stem calls) שבבלוטת החלב מתחלקים לתאים ראשונים (precursors cells) ולתאים מפרישים (secretory cells). שלב הפרוליפרציה מווסת על ידי: אינסולין, epidermal growth factor (EGP) והורמון גדילה (GH). קבוצת הורמונים זו משמשת כגורם מיטוגני. פרולקטין משמש כגורם המעלה את רגישות התאים לאינסולין וכנראה משמש כגורם מיטוגני בעצמו. בשלב הדיפרנציאציה בו מתפתחים התאים המפרישים, יש תפקיד חשוב לקורטיזול בשילוב עם אינסולין ופרולקטין. (cowie et al 1980).
רקמת השומן של העטין נחשבה עד לאחרונה לרקמה תומכת ללא פעילות אנדוקרינית\מטבולית במהלך הלקטציה. בסדרה של ניסוים חדשניים שנערכו במעבדתנו בהם בחנו את הקשר בין רקמת השומן לבין הפוטנציאל הלקטוגני של תאי בלוטת החלב, גילנו כי קיים קשר ישיר בין נוכחות של רקמת השומן לבין עוצמת ביטוי חלבוני חלב לאחר גירוי של פרולקטין. כלומר רקמת השומן של בלוטת החלב תורמת ליכולת הלקטוגנית של בלוטת החלב. השאלה שעדין צריך לברר היא, מה ישפיע יותר על התחלובה, גודל תאי השומן (גורם שיכול להיות מווסת באופן תזונתי לקראת סוף תקופת היובש), מספר תאי השומן שבבלוטת החלב (גורם שנקבע במהלך השלבים הראשונים של גידול העגלה) או שני הגורמים יחד. תשובה לשאלה זו תאפשר לחקלאי לתכנן את התפריט התזונתי של עגלות ופרות לפני המלטה. מספר תאי השומן בגוף היונק נקבע בשלב הגדילה (בפרות בשלושת החודשים). מסת תאי השומן (גודל) היא נגזרת של צריכת מזון במהלך תקופת החיים. נושא חשיבות השומן לבלוטת החלב הוצג בכנס האנדוקריני (2006)

תיאור הבעיה:
כושר התחלובה של הפרה החולבת במשק הבקר הישראלי הוא תולדה של תהליך ארוך של טיפוח גנטי ושילוב של התאמה דיאטטי למצב הפיסיולוגי בו נמצאת הפרה. על מנת לשפר את ביצועי הלקטציה של הפרה יש להבין את הקשר בין תזונה, השלב בו נוצרת רקמת השומן בבלוטת החלב וכושר הלקטציה העתידי.

תוצאות ודיון
בעבר הועלתה ההשערה כי למרות שהלפטין "המערכתי" שריכוזו יורד סביב תקופת ההמלטה בבקר, אין זה המצב בבלוטת החלב (Accorsi et al., 2005b). בסוף שנות ה-70 החלו להצטבר עדויות כי יש רקמת שומן בבלוטת החלב בשלבי התחלובה (Howe, Heald, & Bibb, 1975), ויותר מאוחר מצאו ביטוי של רסיסטין ((Resistin – הורמון המופרש מתאי שומן ומהווה את אחד הסמנים לתאי שומן בוגרים) בבלוטת חלב של פרה בתחלובה (Komatsu, Itoh, Mikawa, & Hodate, 2003), בנוסף נמצא ביטוי של אדיפו-קיו ((Adipo-Q בשתלים של בלוטת חלב שנאספו מפרות חולבות, אדיפו-קיו הוא גן המבוטא באופן בלעדי בתאי שומן (ראה תמונה 1). כלומר, למרות שהיה מקובל לחשוב כי רקמת השומן כמעט ונעלמת במהלך התחלובה בבקר, ככל הנראה אין זה המצב וכי כמות תאי השומן בבלוטת החלב במהלך התחלובה יורדת אך חד משמעית תאים שומן אינם נעלמים, ויותר מזה, מתוצאות הניסויים שבוצעו, עולה כי, המעט שישנו מעורב בויסות תהליך התחלובה. על מנת לבסס את ההיפותזה כי לפטין שמקורו ברקמת שומן העטין או בתאי השומן בבלוטת החלב אכן מעורב בויסות התחלובה בכלל ובתהליך הלקטוגנזה בפרט, הוקמה מערכת של תרביות משותפות שהכילו תרבית תאים ראשונית שהופקה מבלוטת חלב של פרה בלקטציה ומעליהם הורחפו שתלים של שומן שנלקח מהחלק האחורי של בלוטת החלב . על מנת להעריך את ההשפעה של הטיפולים ההורמונלים השונים על השתלים והתרביות הראשוניות השונות שנאספו מפרות שונות, לפני כול התחלה של ניסוי במערכת הגדרנו תקופת "הרעבה" לשתלים. כלומר לאחר השתלים של בלוטת החלב שהובאו מבית המטבחיים, הוחזקו במדיום שהכיל אינסולין לבד לתקופה של 2-3 ימים. מטרת השלב הזה בניסוי הייתה לבטל את הזיכרון ההורמונאלי של השתלים על מנת שנוכל להעריך את ההשפעה של הטיפולים השונים לבחון. במערכת זו ניתן היה לבחון את ההשפעה של רקמת שומן שמקורה בבלוטת החלב על התאים האפיתליאליים. ואכן, מהתוצאות עולה כי, בנוכחות של רקמת שומן ופרולקטין, הפוטנציאל הלקטוגני של התאים האפיתליאליים עולה באופן דרמטי (ראה גרף 4). חיזוק להשפעה החיובית של רקמת השומן על התאים האפיתליאליים של בלוטת חלב ניתן למצוא בעבודתו של Hovey (Hovey, MacKenzie, & McFadden, 1998) בה נבחן האפקט המיטוגני של רקמת שומן העטין על תאים אפתיליאלים מבלוטת שומן של עכבר. על בסיס ניסויים אלו עלתה ההנחה כי פרולקטין ככול הנראה משפיע על הורמונים המופרשים מרקמת השומן ויכולים לווסת את רמת התחלובה. חיזוק נוסף לממצאים אלו ניתן למצוא גם בעבודתו של Baratta משנת 2003 (Baratta, Grolli, & Tamanini, 2003) שבין היתר בחן את ההשפעה של פרולקטין על ביטוי לפטין בקו תאים של אפיתל עטין מעכבר HC11 , ומהממצאים עלה כי פרולקטין לא השפיע על הביטוי של לפטין בקו תאים זה. ממצאים זהים התקבלו גם בניסוי בו נבחנה ההשפעה של פרולקטין על הביטוי של לפטין בתרבית ראשונית של תאי עטין מפרה חולבת (ראה גרף 2). המסקנה היא כי מקור הלפטין המגיב לשינוים ברמת הפרולקטין אינו בתאים האפיתליאליים אלא ככל הנראה ברקמת או תאי השומן שנמצאים בבלוטת החלב או סביבה. חיזוקים נוספים להנחה זו ניתן למצוא בעבודה בה בחנו את הביטוי של לפטין בבלוטת החלב של כבשים ומצאו כי לפטין קיים בבלוטת החלב בעיקר בתאי האפיתל ותאי השומן מתחילת ההיריון ועד אמצע תקופת ההיריון. לקראת ההמלטה ואחריה רמות הביטוי של לפטין בתאים האפיתליאלים יורדות באופן דרמטי (Bonnet, Gourdou, Leroux, Chilliard, & Djiane, 2002). כאשר השוו את רמות הביטוי של לפטין בבלוטת החלב מפרה הנמצאת באמצע תקופת התחלובה ומפרה יבשה גילו כי אין הבדלים משמעותיים ברמות הביטוי של הגן ללפטין בבלוטה (Bartha, Sayed-Ahmed, & Rudas, 2005). ממצא נוסף המחזק את ההנחה כי לפטין מופרש באופן מקומי בבלוטת החלב של סוסות ללא קשר לרמת ריכוזי הלפטין בפלסמה. בעבודה זו, שהתפרסמה לאחרונה בחנו את רמות הלפטין בפלסמה ובחלב הראשוני המופרש מבלוטת החלב (קולוסטרום) סביב מועד ההמלטה, מהממצאים של עבודה זו עולה כי רמות הלפטין בחלב הראשוני עולות עד מועד ההמלטה בעוד בפלסמה נרשמת ירידה ברמות הלפטין (Romagnoli et al., 2007). רקמת השומן שעד לא מזמן נחשבה לרקמה האוגרת אנרגיה בלבד, החלה להתגלות כרקמה אנדוקרינית לכל דבר. ואכן כאשר נבחנה ההשפעה של פרולקטין על הפרשה של לפטין מרקמת שומן העטין נמצא כי יש יחס ישר בין ריכוז הפרולקטין וביטוי לפטין ברקמת שומן העטין והפרשה של לפטין למדיום משתלים של שומן עטין.

תוצאות :

תמונה 1: בחינת הביטוי של הגנים לאלפא-קזאין, אדיפו-קיו ו רנא ריבוזומלי 18S בשתלים של בלוטת חלב (E), תרבית תאים ראשונית (P) ושתלים של שומן עטין (F). כאשר בחנו את רמות הביטוי של אדיפו-קיו (מרקר לתאי שומן) בתרביות השונות, מצאנו ביטוי של גן זה בשתלי השומן ושתלי בלוטת החלב. המסקנה מתוצאות אילו היא כי קיימים תאי שומן בבלוטת החלב בזמן התחלובה. הביטוי של אלפא קזאין נצפה רק בתרביות הראשוניות ושתלי בלוטת החלב. ממצא שנועד לוודא כי הכן מדובר באפיתל מפריש של בלות החלב. בכול התרביות נמצא ביטוי של הגן לרנא ריבוזומלי, כלומר בכול המקרים תהליך הפקת הרנא היה תקין.

גרף 4: התבטאות של חלבון החלב קזאין נבדקה בתרבית של תאי עטין פרה חולבת עם (עמודות מלאות) ובלי (עמודות ריקות) רקמת שומן עטין שצפה במדיום. הטיפול ההורמונאלי שניתן לתאים היה רמות עולות של פרולקטין אשר גרמו לעליה בהתבטאות הקזאין רק בתרבית התאים שעליה צפה רקמת שומן שמפרישה לפטין. הוספת מעכב של לפטין ביטלה את השפעת השומן על תאי העטין עוד נדבך שמראה את חשיבות שומן העטין ביצור החלב. ממצא זה מחזק את ההנחה שלנו כי רקמת השומן מהווה גורם הכרחי בויסות הפוטנציאל הלקטוגני של בלוטת חלב בזמן התחלובה.

מסקנות
מהתוצאות המוצגות בדוח זה עולה כי :
א. נמצא יחס ישיר בין ריכוז הפרולקטין במדיום ורמות הלפטין המבוטא ברקמת השומן והמופרש מרקמת השומן למדיום.
ב. בכל הניסויים בהם נבחנה ההשפעה של פרולקטין או לפטין על מדדים לקטוגנים בתרביות ראשוניות של תאי עטין, לפטין לבדו לא השפיע כלל על מדדים לקטוגנים, פרולקטין השפיע על המדדים, ושילוב של לפטין ופרולקטין הוביל לעליה הגבוהה ביותר במדדים הלקטוגנים.
ג. שילוב של רקמת שומן במערכת הניסוי הובילה לכך שמספיק היה להוסיף פרולקטין למערכת על מנת להגיע לעליה משמעותית במדדים הלקטוגנים אותם בחנתי.
המנגנון המוצע על סמך התוצאות: לקראת סוף ההיריון והתחלת התחלובה רמות הלפטין בגוף הפרה מתחילות לעלות. כתגובה לעליה זו רקמת השומן שנמצאת סביב בלוטת החלב מתחילה להפריש לפטין מצד אחד, ומצד שני רמות הביטוי של הקולטן ללפטין עולה ברקמה האפיתליאלית של בלוטת החלב. רמות הלפטין האנדוגני עולות, בניגוד לרמות הלפטין בדם, שבשלב זה יש ירידה מסוימת בריכוזו בדם ובביטויו בתאים האפתיליאלים שבבלוטת החלב. אותו לפטין אנדוגני שמופרש מרקמת השומן של בלוטת החלב מווסת את רמות הביטוי של הקולטן לאסטרוגן אלפא. במקביל להפרשת הלפטין מרקמת השומן שבבלוטת החלב, פרולקטין מווסת גם את יצור האסטרוגן מרקמת שומן זו. אסטרוגן זה משפיע על מדדים שונים כמו עליה בפרוליפרציה, ועליה בסינתזה של חלבוני חלב בבלוטת החלב. מכאן ניתן להסיק שללפטין האנדוגני בבלוטת החלב יש את היכולת לווסת את פוטנציאל התחלובה סביב מועד ההמלטה, ולאחר מכן הגירוי נעשה בשיתוף עם פרולקטין.

חלק מתוצאות המחקר פורסמו בעיתון International journal of Endocrinologyו

בניסוי גידול העגלות ADLIB בחלב מלא לעומת תחליף חלב נמצאו שלשה פרמטרים חשובים אשר מראים את היתרון במתן חלב מלא לעגלות בנות יום עד 50 יום. הפרמטרים היו משקל המבכירות שנשמר לאורך הגידול על אף ההזנה הדומה של שתי הקבוצות, תנובת חלב גבוהה בקג' ליום במבכירות שהוזנו בחלב בינקותן והגעה מוקדמת לבגרות מינית בקבוצה זו.
בשאר הפרמטרים שנבחנו לא נמצאו שנויים משמעותיים לאורך הגידול.
התוצאות החשובות של ניסוי זה מובאות בטבלא הבאה עם הסבר הטיפולים בתחתיתה.

Table 5. Reproductive performance, body measurements at calving and milk and milk solids yield during the first lactation.

a,b,c,d Means in a row with different letters differ (P < 0.05).
1Heifer calves were fed until weaning either ad libitum milk replacer (MR) or whole milk (M) that was offered for 30 minutes in 2 meals per day. The heifers were fed from 60 to 150 d of age the same ration and at 150 d of age each original group was divided into 2 sub-groups. One of the each subgroup was supplemented with 2% protein until 320 d of age. From 320 d of age all the heifers were housed and fed together until calving.
2Artificial insemination

References
ccorsi, P. A., Govoni, N., Gaiani, R., Pezzi, C., Seren, E., & Tamanini, C. 2005 Leptin, GH, PRL, insulin and metabolic parameters throughout the dry period and lactation in dairy cows. Reprod Domest Anim, 40(3): 217-223.
Bartha, T., Sayed-Ahmed, A., & Rudas, P. 2005. Expression of leptin and its receptors in various tissues of ruminants. Domest Anim Endocrinol, 29(1): 193-202.
Bonnet, M., Gourdou, I., Leroux, C., Chilliard, Y., & Djiane, J. 2002. Leptin expression in the ovine mammary gland: putative sequential involvement of adipose, epithelial, and myoepithelial cells during pregnancy and lactation. J Anim Sci, 80(3): 723-728.
Cowie, A. T., Forsyth, I. A., & Hart, I. C. 1980. Hormonal control of lactation. Monogr Endocrinol, 15: I-XIV, 1-275.
Hovey, R. C., MacKenzie, D. D., & McFadden, T. B. 1998. The proliferation of mouse mammary epithelial cells in response to specific mitogens is modulated by the mammary fat pad in vitro. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 34(5): 385-392.
Hovey, R. C., McFadden, T. B., & Akers, R. M. 1999. Regulation of mammary gland growth and morphogenesis by the mammary fat pad: a species comparison. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 4(1): 53-68
Komatsu, T., Itoh, F., Mikawa, S., & Hodate, K. 2003. Gene expression of resistin in adipose tissue and mammary gland of lactating and non-lactating cows. J Endocrinol, 178(3): R1-5.
Laud, K., Gourdou, I., Pessemesse, L., Peyrat, J. P., & Djiane, J. 2002. Identification of leptin receptors in human breast cancer: functional activity in the T47-D breast cancer cell line. Mol Cell Endocrinol, 188(1-2): 219-226.
Lee, G. H., Proenca, R., Montez, J. M., Carroll, K. M., Darvishzadeh, J. G., Lee, J. I., & Friedman, J. M. 1996. Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature, 379(6566): 632-635.
Romagnoli, U., Macchi, E., Romano, G., Motta, M., Accornero, P., & Baratta, M. 2007. Leptin concentration in plasma and in milk during the interpartum period in the mare. Anim Reprod Sci, 97(1-2): 180-185.