מחקר 820-0186-07
השפעת מנת חולבות על בקרת התבטאות ופעילות אמינו-פפטידאזות בעטין של מעלי גירה: קליטת פפטידים ברקמת העטין
דו"ח מסכם מוגש ע"י: סמיר מבג'יש
חלק מעבודה זו פורסם בכתב העת J. Dairy Science לכן מובא כאן את התקציר של המאמר שסיכם את המחקר בדוח שנתי בשנה שעברה. כמו כן, מובא התקציר של עבודת המסטר של טלי דרייפנגר שעשתה את עבודתה על הנושא.
תקציר של עבודת הגמר של טלי דרייפנגר. עבודה זו פורסמה באוניברסיטה העברית, הפקולטה לחקלאות.
השפעת הרכב חלבון מטבולי במעי הדק על ריכוז פפטידים וחומצות אמינו בדם העורקי וביטוי האנזים אמינו פפטידאז N ברקמת העטין של עזים חולבות
במחקר זה נבדקה השפעת עירוי קיבתי של קזאין הידרוליזאט על פרופיל פפטידים בדם וביטוי האנזים אמינופפטידאז N (APN) בעטין העז. מזה מספר שנים ידוע כי חומצות אמינו חופשיות אינן המקור היחידי לסינתזת חלבון בעטין מעלי גירה, מקור נוסף לחומצות אמינו הם הפפטידים במחזור הדם.
ארבעה עזים מזן זאנן באמצע תקופת הלקטציה עם קנולה באבומאזם קבלו שני טפולים, האחד עירוי של קזאין הידרוליזאט (C) והשני עירוי של מים (W) כביקורת. עירוי הקזאין שימש על מנת להעלות את ריכוז הפפטידים הנספגים מהמעי לדם. עירוי הקזאין סיפק 30% מכלל החלבון המטבולי המחושב שנצרך בזמן הניסוי, בכך ירד ריכוז חומצות האמינו החופשיות המסופקות מהמזון.
בתום 10 ימי אינפוזיה נלקחו דגימות דם מהוריד האבדומינלי והעורק הקרוטי על מנת לבדוק ריכוז פפטידים בדם וזרימות דם לעטין. כמו כן, נלקחה ביופסיה מרקמת עטין על מנת לבדוק רמת ביטוי הגן וחלבון APN.
הטיפולים דמו ביניהם בצריכת מזון (W = 1159.60, C = 1324 SE = 165 P< 0.5553), ייצור חלב ( W = 1044, C = 972 SE = 102 P< 0.6676), תכולת חלבון בחלב (W = 2.6, C = 2.65 SE =0.26 P< 0.8857), וזרימות דם לעטין (W = 80.4L/h, C = 76.2 L/h SE = 18.5 P< 0.4653) . עירוי הקזאין גרם לשינוי בפרופיל הפפטידים בדם העורקי והורידי, ריכוז הפפטידים שגודלם קטן מ- 1500 Da עלה פי שניים. מתוצאות הניסוי ניתן לראות כי יש הבדל בריכוז הפפטידים בכניסה לעטין וביציאה. ממוצע אומדן ריכוז (שטח) הפפטידים בטיפול הקזאין היה22.27 ± 5.38 בדם עורקי, ובדם ורידי ממוצע ריכוז הפפטידים הייתה 68.95 ± 124.44ואילו בטיפול הביקורת ממוצע ריכוז הפפטידים בדם עורקי היה 12.62 ± 2.69, ובדם ורידי 205.1 ± 29.55. בבדיקות ביטוי חלבון APN הייתה עלייה של 58% , ובביטוי הגן המקדד APN נמדדה עלייה של 51% ברקמת עטין של עזים שטופלו בעירוי של קזאין הידרוליזאט לעומת טיפול הביקורת. APN ככל הנראה מהווה חלק חשוב ממנגנון קליטת פפטידים ברקמת העטין, תוצאות הניסויים שנערכו במחקר זה תומכות במסקנה זו. הקטנת ריכוז חומצות האמינו החופשיות בדם גרר מחסור בסובסטרטים זמינים לייצור חלבון חלב בעטין, העלייה בריכוז הפפטידים בדם העזים השלימה את המחסור שנוצר. העלייה בביטוי הגן והחלבון APN מעידות כי ישנה השפעה של ריכוז הפפטידים בדם על פעילות APN, כמו כן, ביציאה מהעטין ריכוז הפפטידים בטיפול הביקורת היה גבוה יותר מאשר בטיפול הקזאין תוצאה אשר מעידה על הידרוליזה ברקמת עטין. מתוצאות הניסויים ניתן להסיק כי מחסור בחומצות אמינו חופשיות והמצאות הפפטידים בדם גרר ביטוי נוסף של האנזים APN ברקמת העטין על מנת לספק לרקמת העטין חומצות אמינו לייצור חלבון החלב, כמו כן ניתן להסיק שהבקרה על ביטוי האנזים כנראה מושפעת מגורמים תזונתיים.
מבוא
מאמצים רבים מושקעים בשנים האחרונות במטרה לייצר חלב בעל תכולת חלבון גבוהה. בנוסף לניסיונות לטפח גנטית פרות בעלות חלב עשיר בחלבון, נלמד הנושא גם על היבטיו התזונתיים, תוך שאיפה להגדיל את יעילות הפיכת החלבון והאנרגיה הניתנים במנה לייצור חלב ומרכיביו (Bequette et al., 2001; Hanigan et al., 2001).
יעילות המרת חלבון הנצרך במנת ההזנה לחלבון חלב הינה נמוכה יחסית ונעה בין 25-30% (Bequette et al., 1998). ניתן להגדיל את תכולת ותנובת חלבון החלב ע"י מתן תוספים חלבוניים במנת החולבות או ע"י עירוי ישיר של חלבונים וחומצות אמינו לתוך קיבת המיצים.
חומצות אמינו חופשיות (Free Amino Acid; FAA) הנמצאות בפלסמה נחשבות כמקור עיקרי למרכיבי מזון חיוניים (נוטריינטים) הנדרשים עבור סינתזת חלבון החלב (Wang et al., (1994. עם זאת, ישנן חומצות אמינו חיוניות שקליטתם מהפלסמה אינה תואמים את הפרשתן בחלב. קליטת חומצות אמינו חיוניות בצורתן החופשית ע"י העטין לפעמים עולה על הפרשתן בחלבון החלב ((Bequette et al., 1998. מאידך, תוצאות ניסויים אחרים נראה שחומצות אמינו חיוניות נקלטות בצורתן החופשית ע"י העטין בכמות קטנה יחסית בהשוואה לכמותן המופרשת בחלבון החלב (MacRae et al., 1988). מממצאים אלו עולה כי ישנם מקורות נוספים המספקים חומצות אמינו חופשיות לעטין לצרכי סנתזה של חלבון החלב (Bequette et al., 1998).
כיום ידוע שחלק מחומצות האמינו מתקיימות בדם כפפטידים המפונים מזרם הדם אל האיברים השונים, עובדה זו מרמזת על הפוטנציאל התזונתי הקיים בפפטידים אלו (DiRienzo, McCormick and Webb, 1982, Seal and Parker, 1991). במחקרים שנעשו על המערכת העורקית-ורידית של בלוטת החלב בפרות, הועלתה ההשערה שישנו מחסור בחומצות אמינו חיוניות לצורך סנתזה של חלבון החלב (Metcalf et al., 1994; Guinard and Rulquin, 1994).
Backwell וחובריה (1994) הוכיחו כי רקמת העטין של עזים חולבות יכולה לנצל די-פפטידים הניתנים באינפוזיה תוך ורידית לטובת סינתזת חלבון החלב. במחקר המשכי שביצעו בשנת 1996 הוכח כי עד 15% מכלל חומצות אמינו חיוניות הנקלטות ע"י העטין, נקלטות כפפטידים מזרם הדם העורקי. בניסוי In-Vitro שנערך בבלוטת החלב של עכברות הוכח כי בלוטת החלב מסוגלת לקלוט את חומצת האמינו ליזין ממקור של פפטידים קצרים במדיום ולנצלה לסנתזת חלבון החלב (Wang et al., 1996). כמו כן, הראו Wang וחובריו (1996) בסדרת ניסויים שערכו בתרביות תאים שנלקחו מעטין פרה כי חומצת האמינו מתיונין נקלטה ונוצלה לסנתזה של חלבוני החלב בתאים.
שתי מערכות הניסוי שהוצגו לעיל מצביעות על היכולת לנצל מגוון של פפטידים קצרים כסובסטרט לחומצות אמינו עבור סינתזה של חלבונים על ידי רקמת העטין באופן יעיל באותה מידה כמו ניצול אותן חומצות אמינו במצבן החופשי.
לאחרונה הוכח כי קיימים ביונקים נשאים של פפטידים ברקמות כמו אפיתל המעי הדק בחולדות ואפיתל הכליה בחזירים. אותם נשאים חולקו לשתי קבוצות עיקריות: PepT-1 המתבטא בעיקר במעי הדק ו PepT-2 המתבטא בעיקר בכליה (Saito et al., 1995; Meredith and Boyd 1995).
במחקר שמטרתו בדיקת התבטאות נשאים לפפטידים ברקמות שונות במעלי גירה, הוכח כי הגן המקודד ל- PepT-1 אינו מתבטא ברקמת העטין של פרות חלב וכבשים (Chen et al; 1999). Wang וחובריו (1996) הראו כי לא קיים ביטוי לגן המקודד לנשאים של פפטידים על גבי העטין. כפי הנראה, בהיעדר נשאים מתאימים על גבי ממברנות תאי העטין, קיימים מנגנונים חלופיים לכניסת פפטידים קצרים אל תוך התאים.
אמינופפטידאזות
הפפטידאזות ככלל הינם קבוצה הטרוגנית של אנזימים הפועלת על מיגוון רחב של סובסטרטים (Kenny and Maroux, 1982). אמינופפטידאזות: אנזימים השייכים למשפחת האקסו-פפטידאזות (מפרקי ח' אמינו מהקצוות) וכוללים:
אחד האנזימים השכיחים בקבוצת הפפטידאזות הינו האנזים אמינופפטידאז N) APN). זהו גליקופרוטאין המעוגן אל ממברנת התא ושייך למשפחת ה – metallopeptidases, חלבונים המכילים אטום מתכת עבור כל תת יחידה של חלבון. באמינופפטידאז N יון המתכת הוא אבץ Zn+2 (Lekhy et al., 1973). אנזים שכיח נוסף הינו אמינופפטידאז A אשר מכיל יון סידן Ca+2 בתת היחידות של החלבון (Stewartand and Kenny, 1984).
הנחות העבודה
פפטידים הקיימים בזרם הדם מנותבים אל רקמת העטין ועוברים הידרוליזה על גבי ממברנות התאים לחומצות אמינו חופשיות אותם לחומצות אמינו חופשיות המועברות פנימה אל תאי האפיתל המפרישים.מכאן שקיימת הידרוליזה ברמה הקפילרית.
הנחת העבודה הינה כי האנזים אמינופפטידאז ממוקם בצידה הבזאלי של ממברנת תאי האפיתל, ומהווה אחד מהמנגנונים התורמים לקליטת פפטידים אל תוך העטין.
מטרות המחקר
בדיקת השפעת שינוי בריכוז פפטידים בזרם הדם העורקי על התבטאות APN ברקמת העטין של עזים חולבות ומדידה כמותית של קליטת חומצות אמינו ופיפטידים ברקמת בטיפולים השונים.
חומרים ושיטות
בעלי חיים בניסוי
עזים חולבות מזאן "זאנן מקומי" הנמצאות באמצע תקופת הלקטציה שימשו לצורך הניסוי. העיזים הוחזקו בדיר הפקולטה לחקלאות תחת משטר הזנה מתאים ותנאי סביבה מבוקרים. מנות ההזנה בניסוי תוכננו לפי צרכי קיום וייצור של העיזים (עפי טבלאות AFRC 1993 ). מנות הטיפול סיפקו את צרכי האנרגיה המטבולית ו – 70% מצרכי החלבון המטבולי. 30% שנותרו של צרכי החלבון המטבולי השלמו ע"י עירוי לתוך קיבת המיצים, של תמיסות שהכילו הידרוליזטים חומציים של קזאין (Casein Acid Hydrolisate – Sigma no. A-2427).
מנות ההזנה הכילו תערובת חולבות + שחת בקיה קצוצה. האבסת המזון נעשתה באמצעות מאביס אוטומטי וחולקה ל–12 מנות שסופקו מדי שעתיים במהלך היממה. כמות הקזאין שעורתה הותאמה מדי יום לכמות המזון הנצרכת.
מהלך ומתכונת הניסוי
ארבעה עזים נותחו לצורך השתלת קנולה בקיבת המיצים ((Abumasum, אשר דרכה בוצע עירוי תמיסות הטיפולים. ניתוח נוסף בוצע באזור הצוואר לצורך הרמת העורק הקארוטי לאזור תת עורי על מנת לאפשר איסוף דם עורקי בשלבים שונים של הניסוי. כל הניתוחים בעזים בוצעו בהרדמה מלאה בהתאם להנחיות ועדת האתיקה.
הניסוי בוצע במתכונת Cross over design שכלל שני טיפולים ושתי תקופות. הטיפולים היו עירוי קיבתי של מים (ביקורת) ועירוי של תמיסה המכילה הידרוליזאט של קזאין. כמות ההידרוליזאט הוותה 30% מצריכת החלבון המטבולי של העז. תמיסות העירוי תוכננה מדי בוקר והתואמה לצריכת המזון של היום הקודם.
תקופת העירוי נמשכה ב-10 ימים. ביום ה- 11 הושתל לעזים שני קטטרים בווריד הבטן ואחר בעורק הצוואר. אחד מהקטטרים בווריד הבטן הוחדר לכיוון העטין והאחר הוחדר לכיוון בית החזה. הקטטר הפרוקסימאלי לעטין שימש לעירוי תמיסה המכילה סמן pAH; para-amino) (hepuric acid והשני להוצאת דם.
הקטטרים הנ"ל אפשרו מדידת זרימת דם לחצי עטין (הנבדק). למרות הידיעה שבשיטה זו אומדן זרימת הדם הנמדד עשוי להיות נמוך מהערך האמיתי (בגלל סיבות טכניות הקשורות לזרימת דם צדדית בעורק הפודאלי) שיטה זו שימשה למדידה הנ"ל בהנחה שאותה שגיאת מדידה התרחשה בכל העזים.
ביום הדיגום נלקחו לפחות 4 דגימות דם רצופות, בהבדל של 60 ד' ביניהן, וחלב בו זמנית. שעה לפני תחילת הדיגום העטין נחלב עד תום באמצעות חליבה וסחיטה ידנית. לאחר תום יום הדיגום דוגמית מרקמת עטין נלקחה מהצד הנבדק ע"י ניתוח. הניתוחים יבוצעו תחת טשטוש החיה והרדמה מקומית.
לאחר החלמה מלאה וחזרה לתנובות חלב זהות לאלו מלפני הניתוחים (4-7 ימים) העזים קיבלו את הטיפול השני (מים או תמיסת הידרוליזאט) באותה מתכונת המתוארת לעיל.
הפקת RNA מרקמת העטין
הפקת RNA תעשתה באמצעות Tri – reagent מחברת (Molecular Reaserch Center INC) אשר מתבסס על שיטתו של (Chomczynski (1993. תכנון הפריימירים נעשו כמתואר בדו"ח השנתי של 2001.
באמצעות הפריימרים, בוצעו מספר ריאקציות RT-PCR שמטרתן לבדוק האם קיימת התבטאות של הגן לאמינופפטידאז ברקמת עטין עז. בודד מקטע cDNA שגודלו 531bp אשר ישמש כגלאי להתבטאות האנזים אמינופפטידאז ברקמת העטין של עזים בטיפולים השונים.
בנוסף לביטוי האמינופפטידאז ברמת הגן בוצעו בדיקות ברמת החלבון בעזרת נוגדנים ספציפיים בטיפולים השונים.
תוצאות ודיון
ייצור חלב, חלבון חלב, חלבון כללי בחלב זרימות דם וצריכת מזון מובאים בטבלה מספר 1. ניתן לראות שייצור החלב ומנרכיבחו דמו בין הטיפולים. ממוצע תנובת החלה היה 1008 גר/יום וצריכת מזון 1242 גר'/יום. העובדה שערכים אלו דמו בין הטיפולים מעידה כי לא נגרם שינוי בכמות הכללית של תרכובות חנקן זמינות המספקות פריקורסורים לסינתזה של חלב וחלבון החלב .
טבלה מספר 1: ייצור חלב ומרכיביו, צריכת מזון וזרימת דם עורקי לעטין בעזים שקיבלו עירוי קיבתי של מים או הידרוליזאט של קזאין לקיבת המיצים.
כמו כן, זרימת דם לכאורה בעטין הייתה 78.3 (ליטר/ שעה) ולא הושפעה מהטיפול התזונתי.
ריכוז (שטחים מתחת לעקומה) פפטידים קטנים (<1500 Da) בדם עורקי של חיות הניסוי
למרות שבדיקה זו איננה כמותית, אבל מהווה מדד טוב לצורך ציון פרופיל הפפטידים בדם העורקי של העזים. את פלסמת העזים הופרדה על קולונת G15 במכשיר FPLC. הממוצעים המוצגים בגרף מס' 1 מתארים את השטחים מתחת לכמטוגרמות של דמי העזים המתארות את ריכוז הפפטידים שמשקלם המלקולרי מתח ל- 1500 דלטון. ניתן להבחין שבעורק העזים שעורו בתמיסת קזאין בקיבה ריכוז הפפטידים היה גדול יותר מאשר בטיפול המים. תוצאה זו שוב מצביעה על הצלחת הטיפול והשגת המטרה להגדיל את ריכוז הפפטידים בדם העורקי.
גרף מספר 1: ריכוז פפטידים בפלסמה מעורק של עזים אשר עורו מים 1000g/d או הידרוליזאט של קזאין שמהווה 30% מצריכת MP יומית. ( P<0.09 , ±2.69 W= 12.62, 5.38± (C= 22.27
שינוי בפרופיל חומצות האמינו
כדי למדוד את ההבדל בריכוז הפפטידים בין הטיפולים לאחר ההפרדה על הקולונה, הפרקציה נאספה ונשלחה לאנליזה של חומצות אמינו הן במצבן החופשי (לפני הידרוליזה חומצית) והן סה"כ חומצות אמינו חופשיות וקשורות (לאחר הידרוליזה). ההפרש בין ריכוז חומצת האמינו לאחר הידרוליזה לבין זה לפני הידרוליזה נחשב לביטוי חומצות אמינו קשורות לפטידים. גרף מס' 2 מתאר ריכוז חומצות אמינו קשורות (פפטידים) בדם עורקי של עז בטיפול מים לעומת קזאין. ניתן לראות מהגרף כי ריכוז רוב חומצות האמינו קשורות לפפטידים גבוה בטיפול הקזאין מאשר בטיפול המים. פירוט נוסף לתוצאות הופיע במאמר
Mabjeesh et al. 2005. Gene expression and abundance of aminopeptidase N in
caprine mammary gland is influenced by circulating plasma peptide. J. Dairy Sci. 88: 2055-2064.
גרף מספר 2: הפרש בכמות חומצות האמינו בדם עורקי בעז שקבלה שני טיפולים האחד אינפוזיית מים 1000 g/d והשני אינפוזיית הידרוליזאט של קזאין שהיווה 30% מהצריכה היומית של MPI.
שינוי בביטוי האנזים APN בעטין כתוצאה מעירוי פפטידים בעזים
ביטוי האנזים APN ברקמת העטין נבדק על ידי Northern Blot שנעשה על m-RNAשהופק מרקמת עטין שנלקחה בביופסיה (גרף מס' 3). נבדקה רמת ביטוי האנזים APN ובנוסף נבחר גן S18 שמשמש כ- House Keeping Gene. אפשר לראות כי ביטוי הגן ל-APN ,בטיפול אינפוזיית הידרוליזאט הקזאין, עלה ב- 51% לעומת טיפול הביקורת.(; SEM=4.72: n=4 P< 0.05)
גרף מס' 3 : אנליזת Northern Blot של ביטוי APN ברקמת עטין של עזים אשר טופלו באינפוזיה של מים 1000g/d או עם הידרוליזאט של קזאין במים 1000g/d שמהווה 30% מצריכת MP יומית.
רמת הופעת חלבון APN
על מנת לבדוק רמת הופעת חלבון APN בצד הבזאלי של רקמת העטין נעשה western blot על שלפוחיות ממברנליות שהוכנו מרקמת העטין שנלקחה בביופסיה מעזי הניסוי (גרף מס' 4). בכדי למצוא חלבון APN השתמשו בנוגדן מונוקלונאלי ופוליקלונאלי כנגד CD13 . בתוצאות אפשר לראות כי אינפוזיית הידרוליזאט של קזאין העלתה את רמת ביטוי החלבון APN ב- 58% לעומת טיפול המים . ((p<0.02; SEM = 16.0; n = 4
גרף מספר 4 : אנליזת Western Blot על רקמת עטין שנלקחה בביופסיה מעזים שעברו אינפוזיה של 1000gליום של מים או 1000g/d מים עם תמיסת הידרוליזאט של קזאין אשר מהווה 30% מה-MPI היומי.
נראה כי ביטוי APN מושפע מריכוז הפפטידים בדם העורקי, אנליזת Northern Blot ו – Western Blot של m-RNA וחלבון שהופק משלפוחיות ממברנליות מרקמת העטין של העזים, הראו שהעלייה בכמות ה- PBAA בדם גרמה לעלייה של 51% בביטוי הגן לאנזים APN ברקמות שנדגמו. תוצאה דומה התקבלה כאשר נבדקה רמת ביטוי חלבון APN ברקמה זו, נצפתה עלייה של 58% בביטוי חלבון בטיפול לעומת הביקורת. ה- APN ככל הנראה מושפע מעלייה בריכוז פפטידים בדם העורקי, מכיוון שלא היה שינוי בכמות הכללית של חומצות אמינו שמסופקות לעטין והעלייה במקביל של חלבון ו- m-RNA מעידה כי התוספת בביטוי החלבון באה כדי לספק את דרישת הרקמה לחומצות אמינו לייצור חלבון חלב. Davis and Collier (1985) בדקו את השינויים בתגובת תאי רקמת העטין למחוסר בחומצות אמינו לייצור חלבון חלב מצאו כי שזרימת הדם לכיוון רקמת העטין גדלה על מנת שאספקת חומצות האמינו תגדל. כמו כן, במחקרים נוספים ראו כי בחוסר של חומצות אמינו ישנה עלייה בקליטת חומצות האמינו החסרות ממקורות שונים (חומצות אמינו חופשיות ופפטידים) בדם ( Bequette et al., 2000; Mabjeesh et al., 2002). ככל הנראה מחסור חומצות האמינו החופשיות בדם והעלייה בכמות הפפטידים הם שני סיגנלים הגורמים לרקמה לבטא יותר APN על מנת לפצות על המחוסר בחומצות האמינו החופשיות ובכך לספק לתאי הרקמה את כמות חומצות האמינו הדרושה לצרכי היצור. תוצאה דומה נתקבלה ע"י Raul וחבריו (1987) כאשר בדקו השפעת הזנת רמות שונות של חלבון על ביטוי APN במעי של חולדות, הם מצאו כי מתן רמה גבוהה של חלבון בדיאטה גרמה לעלייה של 81% בביטוי APN ברקמת המעי.
המסקנה מניסויים אלה היא שייצור חלב וחלבון חלב מושפעים מנוכחות סובסטרטים; העלאת כמות פפטידים בדם והירידה בזמינות חומצות אמינו חופשיות גרמה לחוסר זמינות של סובסטרטים לייצור חלבון חלב, מצב זה גרר תגובה ברקמת העטין להגביר את ייצור ה- APN על מנת להגביר הידרוליזה של פפטידים שעוברים דרך נימות הדם בעטין, בכך להעלות את זמינות חומצות האמינו לייצור חלבון חלב.
למעלה
