דו"ח תלת שנתי על שאיבת ביציות מפרות הרות לצורך יצור עוברים In-Vitro

תכנית 353-0147

ד"ר אמיר ערב, ד"ר אמיר בור, חיים גסיטוע, אולגה שניאורסון, יצחק דקל

תקציר
שאיבת ביציות בארץ מתאפשרת רק בתקופת החורף בהן איכות הביציות מאפשרת יצירת עוברים. אולם, בתקופה זו מרבית הפרות במשק הינן בהריון מצב הדורש נסיון בשאיבת ביציות מפרות הרות. הבדל משמעותי לאחר שאיבה נמצא באיכות הביציות והעוברים של פרות הרות לעומת מבכירות: צמיחת זקיקים חדשים לאחר סילוק זקיקים ישנים ושאיבת הביציות מפרות הרות בשחלה קונטרה לטרלית לזו עם הגוף הצהוב נתנו בהרות פי 2 ביציות יחסית לכל שחלה מפרה מבכירה. האחוז ההתחלתי של ביציות איכותיות, המתאימות לגידול בתרבית, גבוה יותר בפרות הרות ושפעול כימי שלהן הביא לאחוזי התלמה (first cleavage) גבוהים יותר. גידול העוברים בתרבית במשך 7 ימים לשלב הבלסטוציסט הביא לאחוזי התפתחות גבוהים יותר בפרות ההרות מאשר במבכירות. שאיבת השחלה הקונטרה לטרלית לגוף הצהוב במהלך ההריון לא הביאה לבעיות וטרינריות וכל ההריונות והמלטות לאחר שאיבת הביציות היו תקינים עם ולדות תקינים.
מבדיקה של פרות הרות נוספות הסתבר שאפשר לשאוב ביציות גם משתי השחלות ולעיתים קרובות (מדי 5 ימים) בלי לגרום לכל נזק. יוצאת מן הכלל היתה פרה הרה מסוימת שנשאבה כ-7 פעמים וממנה הצלחנו להפיק מספר שיא של ביציות (ממוצע של 35 ביציות לשאיבה) שהוא בערך פי 3-4 יותר מן הממוצע המתקבל בקבוצות אחרות בעולם המבצעות שאיבת ביציות . מצאנו שיש בעיות טכניות רבות שמגבילות ואף מונעות שאיבת ביציות מפרות הרות מאחר ואין זיהוי מוצלח של השחלה או הזקיקים בעזרת מכשיר ultra sound כתוצאה מהתקדמות ההריון, העליה במשקל וגדילת הרחם .
הבדל אחד ברור בין שתי קבוצות הפרות הוא רמת הפרוגסטרון הגבוהה והקבועה שיש בפרות הרות ועל כן נבדקה השאלה אם מתן פרוגסטרון חיצוני למבכירות ישפר את איכות הביציות המתקבלות למשל בשיא עונת הקיץ. אך לאחר הטיפול לא נראתה עליה במספר הביציות האיכותיות בפרות המבכירות המקבלות פרוגסטרון. הביציות שנשאבו לא התפתחו לאחר שבוע לבלסטוציסט כראיה לאיכות הביציות הגרועה בעונת הקיץ.

Abstract

Ovum Pick Up (OPU) is possible in Israel only during winter time when oocytes quality enables embryo production. During this period many cows are pregnant and thus OPU has to be tried out on them. A dominant difference in oocytes and embryo quality was monitored in this project: The average number of good quality (grade I + II) oocytes per aspiration cycle from pregnant cows (n=5) was similar (3.8) as in the control group (4.4) (n=5), though in pregnant cows only the contra lateral ovary to the one carrying the Corpus Luteum was aspirated. The yield of good quality oocytes was higher (81.4%) in pregnant cows than in the control group (68.6%). First cleavage rate for oocytes from pregnant cows was 66.6% and in control 55.5%. Blastocyst formation rate was 38% for pregnant cows oocytes and 19.3% for the control group.

An outstanding OPU case report for a pregnant cow showed the average yield of 46 good quality oocytes per OPU cycle when both ovaries were aspirated, an average number of 35.6 good quality oocytes per cycle, 50% of them reached first cleavage and 33% of them grew to the blastocyst stage. No difficulties were monitored in pregnancies and births of OPU treated animals. When we tried to imitate high progesterone levels known in prgnant cows by giving to cows (n=6) a synthetic form called Norgestomet during heat stress in summer period, we failed to show any improvement of any of the above categories.

מבוא
שאיבת ביציות (Ovum Pick Up) היא טכנולוגיה מבוססת כבר שנים רבות בחקר הפוריות בבקר וגם במעבדתנו. שאיבת ביציות בארץ מתאפשרת רק בתקופת החורף בשל איכות הביציות הטובה יותר ליצור עוברים מאשר בקיץ. בתקופת החורף מרבית הפרות במשק הרות. נשאלת השאלה האם גם פרות הרות הן מקור מוצלח לביציות באיכות טובה. האם פרות במשטר אנרגטי שונה יתנו ביציות באיכות שונה והאם יש השלכות למידע הזה כדי לסייע בחקר ירידת פוריות הבקר הנצפית בכל קיץ.
שיטות וחומרים
א. שאיבת ביציות מפרות הרות ומפרות בקורת שאינן הרות- שאיבת הביציות נעשתה בעונת החורף בין שבוע עד 5 שבועות לאחר בדיקת ההריון ע"י פלפציה. גיל ההריון היה 70 – 100 ימים בתחילת השאיבות. הפרות תהיינה במרחק דומה מההמלטה הקודמת. שאיבת הביציות תעשה פעמיים בשבוע במרווח של 4 ימים. בפרות ההרות תשאב רק השחלה הקונטרה-לטרלית לשחלה בעלת הגוף הצהוב.
השאיבה עצמה נעשית לאחר סריקת השחלה בעזרת מערכת אולטרה סאונד תוצרת Pie Medical אליה מחובר גשש טרנסואגינלי סקטוריאלי הנושא מחט בקוטר ) 18Gהמחט מחוברת עצמאית למערכת אספטית לאיסוף נוזלים בואקום) . המחט מוחדרת לזקיקים בקוטר 3-5 מ"מ בלבד. הנוזל הנאסף בטמפ' 37 מ"צ מועבר להמשך טיפול במעבדה.
בידוד הביציות, ההבגרה, ההפריה או השפעול הכימי והגידול עד לשלב הבלסטוציסט נעשה על פי פרוטוקולים קבועים ואחידים משל מעבדתו של P. Hansen בארה"ב.
ב. לשם בדיקת השפעת המאזן האנרגטי של הפרה על איכות הביציות המתקבלות – נבדקו פרות הרות לעומת פרות בתחילת התחלובה (70 יום מהמלטה). כל מהלך השאיבה והטיפול בביציות המתקבלות היה זהה לסעיף א' .
ג. מתן פרוגסטרון חיצוני במטרה להשפיע על איכות ביציות נשאבות בשיא עונת הקיץ – במהלך חודש אוגוסט נבחרו 6 פרות בקורת ו 6 פרות לקבוצת הניסוי. כל הפרות המשתתפות היו 70-100 ימים לאחר ההמלטה. פרוטוקול הניסוי היה כדלקמן: כל הפרות קבלו זריקות פרוסטגלנדין מדי 5 ימים כדי למנוע הופעת גוף צהוב על השחלות שיפריע לצמיחת זקיקים נוספים. תוספת פרוגסטרון חיצוני ניתנה על פי פרוטוקול חברת Intervet ע"י החדרת שתלים תת-עוריים למשך 9 ימים של תכשיר Norgestomet (פרוגסטרון סינתטי) בשם Crestar. 4 מחזורי שאיבה בוצעו ורק ביציות בדרגת איכות גבוהה עברו שפעול כימי וגידול בתרבית למשך 7 ימים.
דגימות דם נלקחו מספר פעמים במהלך הניסוי לזיהוי רמת הפרוגסטרון ע"י אנליזת RIA (Radio Immuno Assay). קבוצת הניסוי נבדקה לנוכחות גופים צהובים ע"י מכשיר Ultra-sound ביום תחילת מתן הפרוגסטרון ושוב בסיום הניסוי.
תוצאות
א. איכות ביציות הנשאבות מפרות הרות
בחורף 2001 נבדקו 4 פרות הרות ע"י 5 מחזורי שאיבה וכן 10 פרות בקורת ע"י 10 מחזורי שאיבה. למרות השאיבה של שחלה אחת בלבד מן הפרות ההרות (כדי לא לסכן את ההריון המתפתח) היה ממוצע הביציות למחזור שאיבה בשתי הקבוצות דומה (3.8 ביציות בהרות, 4.4 ביציות בבקורת). ממוצע קבוצת הבקורת היה דומה לתוצאות שנה קודמת.
לאחר מיון מורפולוגי הסתבר ש 81.4% (n=57) מן הביציות שהתקבלו מן הפרות ההרות לעומת 68.6% (n=243) מן הביציות בבקורת היו באיכות גבוהה המתאימה להמשך גידול.
את שלב ההתלמה הראשון (first cleavage) עברו 66.6% מכלל הביציות האיכותיות שמקורן בפרות ההרות בעוד שבבקורת 55.5% . (על מנת לבטל את השפעת הפקטור הזכרי לא נעשתה הפריה אלא שפעול כימי)
לשלב הבלסטוציסט (לאחר שבוע של גידול באינקובטור) הגיעו 38% מביציות הפרות ההרות
ורק 19.3% מביציות פרות הבקורת.
חשוב לציין שלא נרשמה כל בעיה התפתחותית במהלך ההריון בפרות הנבדקות וכי כולן המליטו המלטה רגילה עם ולדות תקינים.

ב. בדיקת השפעת המאזן האנרגטי של הפרה על איכות הביציות המתקבלות

תוצאות קבוצת הבקורת של פרות בתחילת התחלובה פורסמו ב……………………………………. (ראה פה בפרסומים). הפרות בקבוצת הטיפול (הפרות ההרות) הוחלפו במהלך הניסוי מספר פעמים בשל זיהוי אי התאמתן לשאיבה תוך כדי הניסוי (בד"כ בגלל גדילת הרחם במהלך ההריון המונעת סריקת השחלות בעזרת אולטרה סאונד) ולכן נתוניהם לא ידווחו. דו"ח על פרה הרה אחת שהצטיינה במיוחד מובא לעיל.

בחורף 2002 נבדקה פרה הרה מס' 264 ברפת בית דגן ונשאבה במשך 5 מחזורי שאיבה. הפעם נשאבו שתי השחלות בפרות ההרות בלי לפגוע בגוף הצהוב שעל אחת מהן. מספר הביציות במחזור שאיבה יחיד נע בכל פעם בין 40 ל 60 ביציות ובממוצע 46 ביציות. זהו ממוצע גבוה פי 4.6 מדיווחים בספרות ודיווחים שלנו בשנים קודמות על פרות שאינן הרות. פרות הבקורת (70 יום מהמלטה) נשאבו בשתי השחלות ונתנו כמו בשנים קודמות בממוצע כ 4.5 ביציות למחזור שאיבה (תמונה מס' 1).

תמונה מס' 1: סך הביציות המתקבלות

בבדיקת איכות הביציות הנקבעת בצורה מורפולוגית מיד לאחר שאיבתן הסתבר שמרבית הביציות באיכות גבוהה המתקבלות מן הפרה ההרה – ממוצע של 35.6 ביציות טובות מתוך 46 ביציות בכל מחזור בעוד שפרות הבקורת נתנו 2.0 ביציות מתוך 4.5 ביציות במחזור (תמונה מס' 2).

תמונה מס' 2: איכות הביציות המתקבלות

התפתחות הביציות לאחר שפעול כימי נמדדה לאחר ההתלמה הראשונה ולאחר שבוע גידול באינקובטור לפי הגעה לשלב הבלסטוציסט . הפרה ההרה נתנה 50% התלמה ו- 33% בלסטוציסטים בעוד שפרות הבקורת אחוזים בודדים בלבד. חשוב לציין שלא נרשמה כל בעיה התפתחותית במהלך ההריון בפרה ההרה המדווחת וכי המליטה עגלה במשקל תקין ובהמלטה רגילה.

ג. מתן פרוגסטרון חיצוני לשיפור איכות הביציות הנשאבות בשיא עונת הקיץ

באופן כללי נאסף מספר קטן מאוד של ביציות מכל קבוצה בכל מחזור. (6-13 ביציות למחזור מ 6 פרות). 70-80% מתוכם היו בדרגת איכות מורפולוגית גבוהה אך אף ביצית בשתי הקבוצות לא גדלה לשלב הבלסטוציסט (טבלה מס' 2).

מעקב אחר גופים צהובים הראה שאלה שהיו בתחילת הניסוי נותרו גם בסופו וגופים צהובים חדשים צצו על שחלות נוספות במהלך הניסוי. רמת הפרוגסטרון בדם במהלך הניסוי לא עלתה מעל הרמה ההתחלתית אף שנבדקה בנקודות זמן שונות (טבלה מס' 3).

דיון

א. איכות ביציות הנשאבות מפרות הרות

התוצאות מורות על יכולתן של פרות הרות לגדל זקיקים חדשים לאורך זמן למרות נוכחות גוף צהוב. מספר הביציות האיכותיות הממוצע לפרה המתקבלות משחלה אחת דומה לזה המתקבל משתי שחלות יחד בפרות הבקורת. מרווח הזמן המתאים לשאיבת ביציות מן הפרות ההרות הוא מוגבל שכן אם התקדמות ההריון לא ניתן היה להמשיך ולשאוב מן הפרות ההרות בגלל גדילת הרחם ובעקבות כך הקושי הטכני לבצע אולטרה סאונד רקטאלי.

הפרות ההרות יכולות לשמש מקור מצוין לביציות תקינות ואיכותיות אף יותר מפרות הבקורת. התפתחותן של ביציות מהפרות ההרות לאחר שפעול כימי נראית לכאורה מוצלחת ומבטיחה יותר בכל שלב שנבדק בגידול in-vitro

שאיבת הביציות לא פגעה במהלך ההריון של הפרות המשתתפות ואף לא בעגלים שהתקבלו.

ב. בדיקת השפעת המאזן האנרגטי של הפרה על איכות הביציות המתקבלות

ניתן לראות במקרה פרטי זה של פרה הרה מצטיינת במיוחד ששאיבת ביציות מפרות הרות עשויה לתת מספר ביציות ואיכות גבוהים לאין שיעור מאשר מפרות שאינן הרות והנמתאות במשטר אנרגטי אחר. יתכן והסיבות לתוצאות המוצלחות מפרה מצטיינת זו ואחרות הן הורמונליות למשל בגלל רמות פרוגסטרון גבוהות וקבועות שיש בפרות הרות.

ג. מתן פרוגסטרון חיצוני לשיפור איכות הביציות הנשאבות בשיא עונת הקיץ

עונת הקיץ מאופינת במספר זקיקים נמוך כפי שגם רואים בניסוי זה. אין התפתחות של זקיקים חדשים במספרים הדומים לעונת החורף. אחוז הביציות באיכות מורפולוגית גבוהה דומה לזה שבחורף אך התפתחותן גרועה לאין שעור . פרוטוקול הניסוי לא נתן את התוצאות שנצפו בפרות הרות בחורף בהן רמת הפרוגסטרון גבוהה.

חוסר עליית רמת הפרוגסטרון בדגימות הדם שנבדקו עשוי להיות בגלל שקיט ה-RIA המסחרי אינו מזהה את התחליף הסינתטי שניתן לפרות אלא את הפרוגסטרון הטבעי או שבעונת הקיץ הטיפול הנ"ל אינו עובד.

מסקנות

השימוש של פרות הרות לשאיבת ביציות נראה כדאי ומעשי ביותר בלי לסכן את הפרה ואת העובר שהיא נושאת. מאחר ובעונת החורף מספר ההרות בעדר הוא גבוה הרי שמתבקש להשתמש גם באוכלוסיה זו. אם השאיבה נעשית בצורה זהירה ומיומנת הרי שאפשר לשאוב גם משתי השחלות של הפרה ההרה ולהבטיח קבלת ביציות במספר גדול ובאיכות גבוהה ובעקבות כך גם בלסטוציסטים רבים יותר מאשר מפרות שאינן בהריון.

מאמרים שפורסמו בעקבות עבודת OPU

Argov N, Arav A, Sklan D. Theriogenology. 2004 Apr 1;61(5):947-62

Number of oocytes obtained from cows by OPU in early, but not late lactation increased with plasma insulin and estradiol concentrations and expression of mRNA of the FSH receptor in granulosa cells.

Roth Z, Arav A, Bor A, Zeron Y, Braw-Tal R, Wolfenson D.

Reproduction. 2001 Nov;122(5):737-44

Improvement of quality of oocytes collected in the autumn by enhanced removal of impaired follicles from previously heat-stressed cows.