שיפור ההתעברות של "פרות חוזרות בהזרעה" (Repeat breeder cows) באמצעות טיפולים הורמונאליים

משה קאים, עוזי מועלם וחיים גסיטוע – מינהל המחקר החקלאי, המכון לחקר בעלי חיים

תקציר

תופעת "החזרה בהזרעה" (Repeat breeding) של פרות חלב, פוגעת ביעילות הרבייתית והכלכלית של העדר, עקב הדחייה המשמעותית במועד ההתעברות אחר ההמלטה הגורמת להארכה חריגה במרווח בין המלטות עוקבות, ובהוצאות הגבוהות לתחלופה של הפרות שהוצאו מהעדר בגין אי-התעברות. המחקר נערך בשני שלבים. בשלב הראשון כימתנו את השפעות מתן שני טיפולים הורמונאלייים לקראת מועד הזרעה מתוזמן, על שיעורי ההתעברות בשני עדרים (367 מבכירות ופרות). מבכירות ופרות הוקצו לפי מספר ההזרעה, לאחת משלוש קבוצות הניסוי הבאים:

1. ביקורת – מבכירות ופרות קבוצה זו יוזרעו בממשק הרבייה המקובל ללא כל טיפול.

2. טיפול א' – (PG/GnRH) מבכירות ופרות שחזרו בייחום (יום 0) לא הוזרעו וטופלו לפי הפרוטוקול הבא: ביום 7 אחר הייחום ניתנה להן זריקת פרוסטגלנדין (PG), וביום 9 זריקת GnRH. הפרות הוזרעו כעבור כ- 16 שעות ממועד זריקת ה- GnRH.

3. טיפול ב' – (GnRH/PG/GnRH) מבכירות ופרות שחזרו בייחום (יום 0) לא הוזרעו וטופלו לפי הפרוטוקול הבא: ביום 7 אחר הייחום ניתנה לחן זריקת GnRH ראשונה, ביום 14 זריקת פרוסטגלנדין (PG), וביום 16 זריקת GnRH שנייה. הפרות הוזרעו כעבור כ- 16 שעות ממועד זריקת GnRH השנייה.

שיעורי ההתעברות של כלל הפרות היו: 23.3%, 29.2% ו-45.6% בקבוצות ביקורת, טיפול א' וטיפול ב' בהתאמה. השיפור בהתעברות בטיפול ב' נמצא הן במבכירות והן בפרות.

בשלב השני של המחקר המשכנו לבחון את יעילות טיפול ב' (המיטבי) שנמצא בשלב הקודם בהשוואה לפרות ביקורת, בשישה עדרים. כמו כן, ניסינו לפלח את אוכלוסיית הפרות המטופלות ולאתר קבוצה/ות של פרות שאצלן יעילות הטיפול הייתה מירבית.

שיעור ההתעברות הכללי בקבוצות הטיפול היה 39.9% בהשוואה ל-24.4% בקבוצת הביקורת (p<0.0003). הפרות חולקו ל-2 קבוצות הזרעה: 1) הזרעה שלישית ורביעית 2) חמישית ומעלה. לטיפול הייתה השפעה מובהקת על שיעורי ההתעברות בשתי קבוצות ההזרעה. בקבוצת ההזרעות שלישית ורביעית שיעורי ההתעברות בקבוצות הטיפול והביקורת היו 38.7% ו-27.1%, ובקבוצת הזרעות חמישית ויותר היו 40.7% ו-22.4%, בהתאמה. סיכויי ההתעברות של פרה מטופלת גדלים פי 1.7 ו-2.4 בקבוצת הזרעות שלישית ורביעית וחמישית ויותר בהתאמה.

לטיפול הייתה השפעה מובהקת על שיעורי ההתעברות בשתי עונות השנה. בעונת חורף-אביב שיעורי ההתעברות בקבוצות הטיפול והביקורת היו 43.7% ו-26.8%, ובעונת הקיץ-סתיו היו 31.1 ו- 19.5% בהתאמה. לסיכום, הטיפול ההורמונאלי שיפר באופן משמעותי את שיעור ההתעברות הכללי של פרות קשות התעברות, בכל עונות השנה ובכל קבוצות מספרי הזרעה.

מבוא ותיאור הבעיה:  

פרות חוזרות בהזרעה – (Repeat-breeder cows -RBC), היא קבוצה הטרוגנית של פרות בעדר, ללא ממצאים קליניים במערכת המין, החוזרות להתייחם ברווחי-זמן נורמליים ולא התעברו אחר שתיים או שלוש הזרעות עוקבות.

אין ספק שתופעת "החזרה בהזרעה" (Repeat breeding) של פרות חלב, פוגעת ביעילות הרבייתית של העדר, ופוגעת ברווחיות העדר. זאת, כתוצאה מדחייה משמעותית במועד ההתעברות של חלק מהפרות, הוצאה מהעדר בגין אי-התעברות של חלק מהפרות (חלקן בעלות פוטנציאל גנטי גבוה לייצור חלב), הוצאה רבה על תחלופה, עלייה בהוצאות בגין הזרעות מרובות וטיפול ווטרינרי נוסף, וירידה במספר הוולדות הנולדים. פגיעה נוספת ביעילות הכלכלית נובעת מהארכת התלובה המלווה בירידה בתנובת החלב, עידוד השמנת יתר והגדלת הסיכון להפרעות מטבוליות בתחלובה העוקבת.

מסיכומי ספר העדר בשנים 2010 ו-2011, ניתן ללמוד ששיעורי ההזרעות רביעית ומעלה מתוך כלל ההזרעות של המבכירות היו 26% ו-31% ושל הפרות היו 27% ו-30% בהתאמה (1,2).  השכיחות של RBC בעדר מסויים מושפע מממשק רבייה ומגורמי ממשק אחרים, זאת בנוסף לגורמים פיזיולוגיים (29,28,24,19). מחקרים אפידימיולוגים שנערכו בחו"ל מציינים ששיעורי RBC הם בתחום של 25%-10% מכלל הפרות בעדר, ושיעורן בעדרים השונים ובאותו עדר, משתנים ביחס לרמות שיעורי ההתעברות משתי ההזרעות הראשונות (24,17,9). בעדרים בהם שיעורי ההתעברות נמוכים, השכיחות של RBC גבוהה, ובעדרים בהם שיעורי ההתעברות גבוהים השכיחות שלהם נמוכה (24). לפרה החוזרת בהזרעה בתחלובה קודמת, סיכון גבוה יותר להיות כזו גם בתחלובה הנוכחית (19).

סינדרום הפרות חוזרות בהזרעה היא תופעה רב-גורמיות (40,33,19,13). מימצאי מחקרים שנועדו לאפיין את הגורמים הפיזיולוגיים להתעברות הנמוכה של "עגלות ופרות חוזרות בהזרעה" מצביעים על השינויים החריגים הבאים: א. משך ייחום ממושך יותר (18,7); ב. הפרעות ברצף השינויים ההורמונאליים במשך הייחום ובשלב המטאסטרוס (18,7); ג. דחיית מועד שיא-LH ביחס למועד תחילת הייחום, ושיא-LH נמוך יותר (18,7); ד. הפרשת פרוגסטרון מעל הרמה בסיסית הנמוכה סביב הייחום (14,7,6); ה. הארכת משך ההתפתחות של הזקיק הקדם-ביוצי (4); ו. דחיית מועד הביוץ ביחס למועד תחילת הייחום (7); ז. עליה מאוחרת ברמת הפרוגסטרון (23,14,7); ח. רמות פרוגסטרון נמוכה יותר בשלב הלוטאלי (32,10); ט. עליה בשיעור אירועי כשל-בהפרייה (16,5); י. עליה בשיעור אירועי תמותה עוברית מוקדמת (29,17,5).

ניתן לשער שהשינויים החריגים שצוינו לעיל, משפיעים גם על המיקרו-סביבה של הזקיק הקדם-ביוצי ופוגעים באיכות הביצית (31,8). השינוים הפיזיולוגיים החריגים בעגלה או בפרה הפרטנית, הם גורמים אפשריים לכשל בהפרייה ו/או לתמותה  מוקדמת אצל RBC. כשל בהפרייה ותמותה עוברית מוקדמת הם הגורמים הראשים לאי-התעברות של RBC (29,25,17,5).

מאמצים רבים הוקדשו לביסוס טיפולים הורמונאליים שיעודם שיפור ההתעברות של פרות RBC. הגישה בבסיס הטיפולים ההורמונאליים שהוצעו היא לנסות "לתקן" הפרעות רבייה אחר שהן התרחשו. פותחו טיפולים יעודים "לתיקון" הפרעות רבייתיות כגון: תזמון לקוי בין מועדי האירועים – ייחום, שיא-LH וביוץ ופגיעה באיכות הביצית ( 36,35,34,27,4), התפתחות לקויה של הגופיף הצהוב אחר הייחום (39,38,15), הזרעה כפולה (35), הזרעה מתוזמנת (3, 20, 21, 26,22), והשתלת עוברים לעקוף את בעיית סביבה רחמית לא-נאותה (37,12). הפרעות רבייה הן ברובן תולדה של התפתחות לא-תקינה של הזקיק הקדם-ביוצי בפרק הזמן לקראת הביוץ. תוצאות המחקרים שבחנו את יעילות הטיפולים ההורמונאליים הנ"ל לא-עקביות ובעלות הצלחה מועטה. למעשה, אין היום טיפול יעיל שמומלץ לשיפור ההתעברות של RBC.  

המחקר הנוכחי נערך בשני שלבים. בשלב הראשון בחנו בשני עדרים את השפעות מתן שני טיפולים הורמונאלייים לקראת מועד הזרעה מתוזמן, על שיעורי ההתעברות של פרות RBC.

שני הטיפולים נבדלו ביניהם בשיעורי ההתעברות שהושגו בהשוואה לפרות הביקורת. בשלב השני של המחקר המשכנו לבחון בשישה עדרים את השפעת הטיפול המיטבי שנמצא בשלב הקודם.

שלב א' –  בחינת שני טיפולים הורמונאליים בהשוואה לביקורת

מטרת העבודה: לכמת ולהשוות בין שיעורי ההתעברות של RBC, שטופלו בשתי שיטות הורמונאליות לקראת מועד ההזרעה, ובין שיעורי ההתעברות של קבוצת פרות ביקורת שהוזרעו בממשק הרבייה המקובל.

שיטת הביצוע: העבודה נערכה בשתי רפתות: רפת דרום-קיבוץ גת במשך 15 חודש, וברפת הנגב – קיבוץ גבולות במשך 9 חודשים. ברפת הדרום נכללו מבכירות ופרות מהזרעה שלישית ויותר (200 פרות) וברפת הנגב מהזרעה רביעית ויותר (167 פרות). המבכירות והפרות הוקצו לפי מספר ההזרעה, לאחת משלוש קבוצות הניסוי הבאים:

1. ביקורת – מבכירות ופרות קבוצה זו הוזרעו בהתאם לממשק הרבייה המקובל ללא כל טיפול.

2. טיפול א' – (PG/GnRH) מבכירות ופרות שחזרו בייחום (יום 0) לא הוזרעו, וטופלו לפי הפרוטוקול הבא: ביום 7 אחר הייחום ניתנה להן זריקת פרוסטגלנדין (PG) (אסטרופלאן 2.0 סמ"ק), וביום 9 זריקת  GnRH(גונבריד 1.5 סמ"ק). הפרות הוזרעו כעבור כ- 16 שעות ממועד זריקת ה-GnRH.

3. טיפול ב' – (GnRH/PG/GnRH) מבכירות ופרות שחזרו בייחום (יום 0) לא הוזרעו, וטופלו לפי הפרוטוקול הבא: ביום 7 אחר הייחום ניתנה לחן זריקת GnRH ראשונה (גונבריד 1.5 סמ"ק), ביום 14 זריקת פרוסטגלנדין (אסטרופלאן 2.0 סמ"ק), וביום 16 זריקת GnRH שנייה. הפרות הוזרעו כעבור כ- 16 שעות ממועד זריקתGnRH השנייה (גונבריד 1.5 סמ"ק). הקצאת הפרות לקבוצות הניסוי ומתן הטיפולים בוצעו על ידי צוות ברפת.

בכל הטיפולים פרות שהוגשו להזרעה ונפסלו ע"י המזריע (מוגלה או חוסר טונוס), הוזרעו מאוחר יותר אחר שהופיעו בייחום. פרות אלו לא נכללו בסיכום התוצאות. פרות מכל קבוצות הניסוי שחזרו בייחום כעבור מספר ימים מועט אחר מועד ההזרעה, ואובחנו כציסטיות לא נכללו בסיכום התוצאות. פרות שהוזרעו במסגרת אחת מקבוצות הניסוי וחזרו בייחום, שובצו מחדש לאחת משלושת מקבוצות הניסוי.

תוצאות: תוצאות שיעורי ההתעברות של שלושת קבוצות הניסוי מוצגים בטבלה 1. שיעורי ההתעברות של כלל הפרות היו: 23.3%, 29.2% ו-45.6% בקבוצות ביקורת, טיפול א' וטיפול ב' בהתאמה. השיפור בהתעברות בטיפול ב' נמצא הן במבכירות והן בפרות. לכן, טיפול ב' נבחר להמשך העבודה.

טבלה 1. השפעת הטיפול ההורמונאלי על שיעורי ההתעברות בהתייחס למספר התחלובה

* בסוגריים מספר הרות/מספר פרות שהוזרעו. ^b,a      הבדל מובהק (p<0.01).

שלב ב' –  בחינת הטיפול ההורמונאלי המיטבי בהשוואה לביקורת

מטרות העבודה: א. לבדוק את יעילות הטיפול ההורמונאלי לשיפור סיכויי ההתעברות של  RBC בעדרים שונים, בהשוואה לפרות ביקורת; ב. לפלח את אוכלוסיית הפרות המטופלות ולאתר קבוצה/ות של פרות שאצלן יעילות הטיפול הייתה מירבית.

שיטת הביצוע: הניסויים נערכו בשישה עדרים: אשדות יעקב מאוחד, בית רימון, גת, מירב, שומריה ושובל במשך שנה לפחות. הקצאת הפרות לקבוצות הניסוי ומתן הטיפולים בוצעו על ידי צוות ברפת. בכל אחד מהעדרים, הוקצו מבכירות ופרות מהזרעה שלישית ואילך על פי מספר ההזרעה, לאחת משתי קבוצות הניסוי הבאות:

1. ביקורת – מבכירות ופרות קבוצה זו הוזרעו אחר חזרתן בייחום כמקובל.

2. טיפול – (GnRH/PG/GnRH) מבכירות ופרות שחזרו בייחום (יום 0) לא הוזרעו, וטופלו לפי הפרוטוקול הבא: ביום 7 אחר הייחום ניתנה זריקת GnRH ראשונה (גונבריד 1.5 סמ"ק), ביום 14 זריקת פרוסטגלנדין (אסטרופלאן 2.0 סמ"ק), וביום 16 זריקת GnRH שנייה (גונבריד 1.5 סמ"ק). הפרות הוזרעו למחרת ללא קשר להופעה בייחום (הזרעה מתוזמנת). רווח הזמן המומלץ בין מועד מתן זריקת GnRH שנייה ובין מועד ההזרעה הוא עד 16 שעות. פרות שהוזרעו במסגרת אחת מקבוצות הניסוי וחזרו בייחום, שובצו מחדש לאחת מקבוצות הניסוי. בעדר מספר חמש, טופלו רק פרות מהזרעה חמישית ויותר. בעדר מספר שש, הפרות הוזרעו אחר רווח זמן ארוך יותר (20 שעות ויותר), ממועד מתן זריקת GnRH השנייה. זאת, בהשוואה לרווח זמן מומלץ עד 16 שעות בחמשת העדרים האחרים.

בסיס הנתונים כולל 2064 הזרעות. סיכויי הפרה להתעבר נבדק בניתוח רגרסיה לוגיסטית אשר כלל את הגורמים הבאים: קבוצות ניסוי, עדר, תחלובה (מבכירה או פרה בוגרת), מספר הזרעה (קבוצת הזרעה 4+3; וקבוצת הזרעה 5 ויותר), עונה (חורף ואביב – חודשים נובמבר עד מאי; קיץ וסתיו- חודשים יוני עד אוקטובר), אירוע מחלות רחם בדרגות חומרה שונות (לפי מספר הטיפולים שנדרשו לריפוי) לפני ההזרעה הראשונה, אירועי מחלות מטבוליות בדרגות חומרה שונות לפני ההזרעה הראשונה, תנובת חלב סמוך למועד ההזרעה ביחס לחציון שחושב לאותו מספר הזרעה, ומרחק ההזרעה מהמלטה ביחס לחציון שחושב לאותו מספר הזרעה. נתוני מצב גופני של הפרות לא נכללו בניתוח הסטטיסטי, בגלל השונות שקיימת בביצוע ההערכה ע"י ופאים שונים.

תוצאות ודיון: שיעורי ההתעברות שהושגו בקבוצות הניסוי בששת העדרים מוצגים באיור 1 ומבטאים את יעילות הטיפול בעדרים השונים.

בחמשת העדרים הראשונים נמצא שיפור משמעותי בשיעורי ההתעברות בעקבות מתן הטיפול ההורמונאלי. שיעורי ההתעברות בקבוצות הטיפול בחמשת העדרים עלו ב- 10.9 עד 23.3 יחידות אחוז בהשווא לשיעורי ההתעברות בקבוצת ביקורת. גודל ההפרש בין שיעורי ההתעברות של קבוצת הטיפול והביקורת בעדרים השונים, יכול להיות מושפע משיעורים שונים של הזרעות שנערכו בעונות חורף-אביב לעומת קיץ-סתיו, וכן משיעורים שונים של הזרעות 3 עד 4 לעומת הזרעות חמש ויותר. בעדר השישי בו הפרות הוזרעו מאוחר מידי ביחס למועד מתן זריקת ה- GnRH השנייה (30), לא נמצאו הבדלים בשיעורי ההתעברות בין קבוצות הניסוי.

איור 1.  השפעת הטיפול על שיעורי ההתעברות (%) בעדרים שונים.

הקשר בין גורמים מסבירים אפשריים ובין הסיכוי של הפרה להתעבר, נבדק בניתוח רגרסיה לוגיסטית. המודל הסופי כלל את הגורמים שנמצאו כבעלי השפעה מובהקת: טיפול, עונה וקבוצת מספר הזרעה. לשאר הגורמים ששולבו בניתוח הסטטיסטי לא נמצאה השפעה מובהקת על שיעור ההתעברות. לא אותרו השפעות גומלין בין הגורמים במודל.

שיעור ההתעברות הכללי בקבוצות הטיפול היה 39.9% בהשוואה ל-24.4% בקבוצת הביקורת (p<0.0003). שיעורי ההתעברות של כלל הפרות בקבוצת הזרעות שלישית ורביעית ובקבוצת הזרעות חמישית ויותר היו 32.8% ו-30.6% בהתאמה (p<0.05). לטיפול הייתה השפעה מובהקת על שיעורי ההתעברות בשתי קבוצות ההזרעה. בקבוצת ההזרעות שלישית ורביעית שיעורי ההתעברות בקבוצות הטיפול והביקורת היו 38.7% ו-27.1%, ובקבוצת הזרעות חמישית ויותר היו 40.7% ו-22.4% בהתאמה (איור 2). סיכויי ההתעברות של פרה מטופלת גדלים פי 1.7 ו- 2.4 בקבוצת הזרעות שלישית ורביעית וחמישית ויותר בהתאמה.

שיעורי ההתעברות של כלל הפרות שהוזרעו בעונת חורף-אביב ובעונת קיץ-סתיו היו 35.3% ו-25.0% בהתאמה (p<0.0001). לטיפול הייתה השפעה מובהקת על שיעורי ההתעברות בשתי עונות השנה. בעונת חורף-אביב שיעורי ההתעברות בקבוצות הטיפול והביקורת היו 43.7% ו-26.8%, ובעונת הקיץ-סתיו היו 31.1 ו- 19.5% בהתאמה (איור 3).

איור 2.  השפעת הטיפול על שיעורי ההתעברות (%) בהתייחס לקבוצות מספר ההזרעה.

איור 3. השפעת הטיפול על שיעורי ההתעברות (%) בהתייחס לעונות השנה.

היות והפרעות הרבייה בפרות RBC הן ברובן תולדה של התפתחות לא-תקינה של הזקיק הקדם-ביוצי והביצית שבתוכו, נקטנו בעבודה זו בגישה טיפולית שונה. שיטת הטיפול שיפרה את שיעורי ההתעברות של RBCובסיסה הרכיבים הבאים: דילוג על הייחום החוזר ואי ההזרעה של הפרה, הטיפול ההורמונאלי מתחיל במועד אחיד ומיטבי במחזור הייחום ותכנות התפתחות של זקיק חדש וצעיר שעתיד לבייץ (זריקת GnRH ראשונהוזריקת PG), השראת שיא LH וביוץ במועד מתוכנן (זריקת GnRH שנייה), הזרעת הפרה במועד מתוזמן שהוא מיטבי ביחס למועד הביוץ הצפוי, ותוספת פרוגסטרון אנדוגני בעקבות ביוץ והתפתחות גופיף צהוב משני (זריקת GnRH ראשונה). היות ובטיפול א' לא קבלנו שיפור בשיעורי ההתעברות, ואילו בטיפול ב' קיבלנו שיפור משמעותי, אנו מניחים כי ההשפעה המיטיבה על שיעורי ההתעברות נובעת מהעובדה שהזקיק המבייץ מקורו בגל-זקיקים השני שהתפתח בסביבת פרוגסטרון גבוהה, ומתוספת הפרוגסטרון האנדוגני שמקורו בגופיף הצהוב המשני במחזור שקדם להזרעה האפקטיבית,.

סיכום: הטיפול ההורמונאלי בטיפול ב' שיפר באופן משמעותי את שיעור ההתעברות הכללי של פרות קשות התעברות, בכל עונות השנה ובכל קבוצות מספרי הזרעה.

ספרות : 

1.       סיכומי ספר העדר 2010. התאחדות מגדלי בקר בישראל.

2.       סיכומי ספר העדר 2011. התאחדות מגדלי בקר בישראל.

3. Alnimer, M.A., and Husein, M.Q., 2007. Reprod. Dom. Anim. 42:363-369.

4. Archbald, L. F., Sumrall, D. P., Tran, T., Klapstein, E., Risco, C. And Chavatte, P. 1993.

Theriogenology, 39:1081-1091.

5. Ayalon, N. 1978. J. Reprod. Fert. 54:483-493.

6. Bage, R., Gustafsson, H., Forsberg, M., Larson, B. and Rodriguez-Martinez, H. 1997.

Theriogenology, 47:141.

7. Bage, R., Gustafsson, H., Forsberg, M., Larsson, B. and Rodriguez-Martinez, H. 2002.

Theriogenology, 57:2257-2269.

8. Båge, R., S. Petyim, B. Larsson, T. Hallap, A.-S. Bergqvist, H. Gustafsson, and

Rodriguez-Martinez, H. 2003. Reprod. Fertil. Dev. 15:115–123.

9. Bartlett, P. C, Kirk, J. H. and Mather, E.C. 1986. Theriogenology 26:309-322.

10. Bulman, D. C. and Lamming, G. E. 1978. J. Reprod. Fert. 54:447-458.

11. Cainzos, J., Beccera, J., Quintela, L., Huanca, T. And Herradon, P. G. 2008. Reprod.

Dom. Anim. 43:57.

12. Dochi, O., Takahashi, K., Hirai, T., Hayakawa, H., Yamamoto, Y. and Koyama, H. 2008.

Theriogenology, 69:124-128.

13. Eddy, R. G., 1994. Cattle Pract. 2:39-45.

14. Ghanem, M. E., Nakao, T., Nakatani, K., Akita, M. And Suzuki, T. 2006. Reprod.

Dom. Anim. 41:180-183.

15. Ghasemzaden-Nava, H., Koshari, H. and Tajik, P. 2006. Reprod. Domestic Anim.

41:346.

16. Graden, A. P., Olds, D., Mochow, C. R., and Mutter, L. R. 1968. J. Dairy Sci. 51:778-781.

17. Gustafsson, H. 1985. Theriogenology 23:487-498.

18. Gustafsson, H., Kindahl, H., Larsson, K., Madej, A. 1986. Anim. Reprod. Sci.19:261-273.

19. Gustafsson, H. and Emanuelson, U. 2002. Acta Vet. Scand. 43:115-125.

20. Kasimanickam, R., Cornwell, J. M. and Nebel, R. 2005. Theriogenology 63:2550-2559.

21. Katagiri, S. and Takahashi, Y., 2006. Anim. Reprod. Sci., 95:54-66.

22. Katagiri, S. 2006. J. Reprod. Dev. 52:133-137.

23. Kimura, M., Nakao, T., Moriyoshi, M. and Kawata, K., 1986. Br. Vet J. 143:560- 566.

24. Levine, H. D. 1999. The Bovine Practitioner 33:97-105.

25. Linares, T. 1982. An imal Reproduction Science. 4:189-198.

26. Mellado, M., A. Zuñiga, F.G. Veliz, A. de Santiago, J.E. Garcia, J. Mellado. 2012.

Anim. Reprod. Sci. 134:105-111.

27. Morgan, W. F. and Lean, I. J., 1993. Aust. Vet. J. 70:205-209.

28. Nakao, T., Mohammad, Y., Koike, K. Yoshida, C. and Yamada, K. 2008. Proc. of

the 25^th World Buiatrics Cong., p.187., Budapest.

29. O`Farrell, K. J., Langley, O. H., Hartigan, P. J. and Sreenan, J. M., Vet. Record

112:95-97.

30. Pursley J. R., Silcox, R. W., and Wiltbank, M. C. 1998. J. Dairy Sci. 73:1766-1772.

31. Revah , I. and Butler, W.R., 1986. J. Reprod. Fert. 106:39-47.

32. Rizzo, A., Minoia, G., Trisolini, C. Manca, R. and Sciorsci, R. L., 2007. Anim.

Reprod. Sci. 100:257-263.

33. Roberts S. J. 1986. Veterinary Obstetrics and Genital Diseases Theriogenology,

ed 3. Woodstocs, Vt, pp.447-559

34. Stevenson, J. S., Frantz, K. D., and Call E. P. 1988. Theriogenology 29:451-460.

35. Stevenson, J.S., Call E. P., and Scoby, K. 1990. J. Dairy Sci. 73:1766-1772.

36. Swanson, L. V. and Young, A. J. 1990. Theriogenology 34:955-963.

37. Takahashi, K., Hirai, T., Hayakawa, H., Dochi, O. and Koyama, H. 2006. J. Reprod. Dev.

52:139-145.

38. Villarroel, A., Martin, A., Bon Durrant, R. H., Deletang, F. and Sischo, W. M.

2004.Theriogenology 61:1513-1520.

39. Walton, J. S., Halbert, G. W., Robinson, N. A. and Leslie, K. E., 1990. Can. J. Vet.Res.,

54:305-308.

40.Yusuf, M., T. Nakao, R. B. Ranasinghe, G. Gautam, S. T. Long, C. Yoshida, K.

Koike, and A. Hayashi. 2010.. Theriogenology 73:1220–1229.